擬南芥O-巖藻糖基轉移酶AtPOFUT1的鑒定及生理功能初探

梁 蓉，謝尚強，趙小明，賈曉晨，尹 恒

(1.大連市糖類農用制劑工程研究中心,遼寧省碳水化合物研究重點實驗室,中國科學院大連化學物理研究所，遼寧大連 116023;2.中國科學院大學,北京 100049)

糖基化作為一種重要的蛋白質翻譯后修飾方式，不僅影響蛋白質的溶解性、穩定性和催化活性，還與蛋白質折疊、定位和轉運等過程密切相關，具有重要的生物學功能[1-2]。根據連接方式和糖鏈結構的不同，糖基化可以分為多種形式[3]，O-巖藻糖基化就是其中一個重要類型。目前，蛋白O-巖藻糖基化的關鍵生物學功能已在動物和臨床研究中逐步揭示，其與胚胎發育、細胞遷移、腫瘤生長及病灶轉移等生理病理過程密切相關[4-9]。

在人體中，蛋白O-巖藻糖基化由O-巖藻糖基轉移酶(POFUT1)、GlcNAc轉移酶FRINGE、B4GALT1、ST6GAL1等多個酶依次催化完成。HsPOFUT1作為催化此修飾反應的第一個酶，具有重要的生物學功能。如當HsPOFUT1基因被敲除或敲減到極低水平時，NOTCH蛋白的折疊、配體識別及內吞作用等會受到顯著影響，進而影響NOTCH信號通路介導的細胞間信息交流及細胞遷移等生物學過程[10-13]。HsPOFUT1主要催化GDP-β-L-巖藻糖(GDP-Fuc)以O-連接方式修飾到含有EGF(表皮生長因子樣，Epidermal Growth Factor-Like)重復序列的底物蛋白上[14-15]。除NOTCHs之外，其他含有EGF樣重復序列的蛋白同樣受到HsPOFUT1的修飾，如人尿纖溶酶原激活劑(uPA)、組織纖溶酶原激活劑(tPA)和凝血因子Ⅶ、Ⅸ、Ⅻ等[13]。

然而在植物中，蛋白O-巖藻糖基化的修飾方式及重要功能大部分還處于未知狀態，目前相關文獻報道極少。2017年，美國杜克大學Taiping Sun團隊發現高等植物特有的O-GlcNAc糖基轉移酶AtSPY實際是一種O-巖藻糖基轉移酶，它可以O-巖藻糖基化RGA蛋白促進其與互作蛋白的結合，從而抑制生長相關基因的轉錄[16-18]。然而RGA蛋白并不具備EGF序列，說明雖然都是蛋白質巖藻糖基轉移酶，但AtSPY與POFUT1的底物選擇性存在明顯不同。2018年內華達大學的Ian S. Wallace 團隊在對擬南芥發育突變體的篩選鑒定時，無意中發現了與HsPOFUT1同源的擬南芥AtPOFUT1在擬南芥生長發育尤其是細胞黏附和花粉管生長方面的重要作用，但是未研究其催化活性[19-20]。

基于上述研究背景，本試驗以鑒定研究擬南芥AtPOFUT1為出發點，在序列比對和生物信息學分析的基礎上，利用畢赤酵母異源表達AtPOFUT1，確定該蛋白具有巖藻糖基轉移酶活性。表達模式分析及后續植株表型明確AtPOFUT1在植物的生長發育尤其是種子發育過程的重要功能。

1 材料與方法

1.1 植物和菌株材料

本試驗以模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)為材料，野生型擬南芥植株(wide type，WT)為哥倫比亞生態型 Col-0(Columbia-0)，突變體為同生態型的SALK_151675C，購自TAIR(https://www.arabidopsis.org/)。

本試驗所用的克隆菌株E.coliTop10和表達菌株畢赤酵母Pichia pastiros X-33以及pPICZαA質粒，均購于Novagen公司。

1.2 試驗試劑與方法

1.2.1 分子及生化試劑 鎳柱填料Ni-NTA sepharoseTMexcel column，購自GE Healthcare公司；超濾杯及超濾膜來自默克密理博Merck Millipore公司，超濾膜規格為10 ku。

反轉錄試劑盒PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、限制性內切酶XhoⅠ、NotⅠ、SacⅠ以及T4DNA 連接酶購于Thermo Fisher公司；Phusion hot star Ⅱ和r-Taq等聚合酶購于寶生物(大連，Takara)有限公司。DNA Marker 購自北京博邁德科技發展有限公司；預染蛋白Marker(Page Ruler Pre-stained Protein Ladder)購于MBI Fermentas公司。

引物由華大基因有限公司合成，具體信息見表1。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in this experiment

PCR擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min。

1.2.2 酶活測定試驗 酶活反應體系為純化酶AtPOFUT1 (2.5 mg/mL) 5 μL，GDP-Fuc (0.1 mg/mL) 5 μL，MgCl2(50 mmol/L) 2.5 μL，Tris-HCl (50 mmol/L,pH=8.0) 15 μL；對照組加入5 μL沸水浴滅活的重組酶AtPOFUT1，其余體系及條件同試驗組。在25 ℃恒溫反應器孵育2.5 h后，沸水浴10 min終止反應。

利用高效液相色譜(HPLC)檢測反應體系中的底物GDP-Fuc的消耗，流動相為2 mmol/L四丁基硫酸氫氨磷酸緩沖液(pH 6.2)。使用Thermo BDS HYPERSIL C18色譜柱，購自Thermo Fisher公司；高效液相色譜系統為依利特 UV230+紫外-可見檢測液相色譜儀；GDP-Fuc標準品購自Carbosynth Product公司。

1.2.3 轉錄組分析 差異表達分析從美國國立生物技術信息中心(NCBI)的基因表達綜合公共數據庫(GEO)篩選擬南芥基因芯片，提取多個轉錄數組，使用筆者實驗室編寫的R語言腳本完成[21]；熱圖分析使用R語言中的pheatmap函數包完成。

1.2.4 植株試驗試劑 擬南芥種子用0.1%升汞消毒后，無菌水漂洗，1/2 MS固體培養基培養7～10 d后轉移到基質土中。培養條件為22 ℃，80%光照，光周期為12 h/12 h(光照/黑暗)。篩選試劑為草胺膦(PPT)，購于 Sigma-Aldric 公司；基質泥炭土購自丹麥品氏公司。

2 結果與分析

2.1 AtPOFUT1的生物信息學分析

利用HsPOFUT1序列限定在擬南芥基因組中BLAST，獲得相似度為12%，綜合評分最高的為擬南芥基因AT3G05320。該基因編碼的蛋白在擬南芥GT65家族中具有較強的代表性，有一個特征性的DUF246結構域[22]。

AT3G05320編碼蛋白由445個氨基酸構成，分子質量為50.65 ku。保守域分析顯示其69～384位屬于O-FucT-like結構域，表明蛋白可能具有O-巖藻糖基轉移酶活性，將該基因命名為Atpofut1。

比較CAZy數據庫中獲得的注釋為擬南芥GT65家族的其他38個O-巖藻糖基轉移酶[23-24]，從NCBI獲得AtSPY和包括小鼠、果蠅、線蟲在內的后生動物的POFUT1，使用MEGA 7.0進行序列比對分析并用Neighbor-joining方法構建系統發育樹(圖1)顯示其進化關系。AtPOFUT1屬于一個單獨的亞分支，與絕大多數擬南芥GT65家族的糖基轉移酶親緣關系相對較近，但不具有同源性，而與其他物種的POFUT1親緣關系較遠。

在蛋白質序列比對的基礎上(圖2-A)，分別以CePOFUT1(PDB ID：3ZY5)和HsPOFUT1(PDB ID：5UX6)作為模板，進行AtPOFUT1三維結構的同源模擬，獲得了AtPOFUT1兩個三維結構模型(圖2-B)。由于蛋白序列同源性僅在12%左右，其結構預測的局部和全局評分均較差，可信度低，但是序列匹配的氨基酸極有可能是關鍵的催化位點。參考三維結構建模及氨基酸序列比對，推測 AtPOFUT1蛋白中關鍵的催化氨基酸位點是R51、H54、R260和D26，這幾個位點可能負責特異性結合GDP-巖藻糖[25-26]。

2.2 AtPOFUT1的基因克隆和異源表達純化

利用特異性引物Pofut-F及R擴增Atpofut1基因全長，瓊脂糖電泳檢測PCR產物，有一條長度約為1 300 bp的單一條帶，其大小符合Atpofut1的1 337 bp(圖3-A)。

分別雙酶切PCR產物和pPICZαA質粒并連接，大腸桿菌top10擴增重組質粒并進行雙酶切驗證。兩條條帶分別與質粒載體(約4 300 bp)和Atpofut1基因(1 337 bp)大小相符(圖3-B)。將重組質粒測序，結果顯示重組質粒上的目的基因就是Atpofut1，未發生突變，重組質粒構建成功。

將測序正確的重組質粒pPICZαA-Atpofut1電轉到畢赤酵母X-33中，用博來霉素篩選出10個轉化子，提取基因組用pPICZαA通用測序引物進行PCR驗證，獲取兩條清晰的條帶，2 200 bp條帶對應畢赤酵母基因組中AOX1醇氧化酶基因，2 000 bp對應Atpofut1(1 337 bp)和質粒pPICZαA上AOX1片段(582 bp)的總長(1 919 bp)(圖3- C)，證明篩選到了正確的畢赤酵母陽性轉化子。

選取正確的畢赤酵母轉化子X-33/pPICZαA-AtPOFUT1誘導表達，甲醇誘導表達72 h時有較多誘導蛋白生成。超濾膜濃縮酵母發酵液上清后，用鎳柱親和層析純化濃縮液，依次用10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L和100 mmol/L咪唑洗脫(圖4泳道2～5)，在40 mmol/L咪唑濃度得到純度較高的目標蛋白。

2.3 重組AtPOFUT1的活性測定

用純化得到的酶液進行酶反應，以沸水浴10 min的失活酶作為空白對照，HPLC檢測底物GDP-Fuc消耗。HPLC檢測不同濃度GDP-Fuc標準品，確定該物質出峰時間為上樣后12 min。對照組在12 min出現與標準品對應的峰，而在酶反應組中此峰消失(圖5)，證明純化得到的蛋白具有巖藻糖基轉移酶活性，即AtPOFUT1具有預期的酶活力。

2.4 Atpofut1差異表達分析

利用現有公共芯片數據對Atpofut1的轉錄水平進行分析，對于揭示其重要的生物學功能具有很強的指導性。根據常見的能夠對植物生長發育產生影響的脅迫環境，選取7種處理條件(物理損傷、高溫、鹽脅迫、寒冷、干旱、滲透壓、植物激素)，分析Atpofut1在各種處理下表達水平的變化。

Atpofut1對部分處理條件有明顯響應，總體來說，在寒冷、高溫、鹽脅迫、干旱和物理損傷(圖6-A～E)下，Atpofut1表達上調；高滲透壓、激素處理(圖6-F、G)使Atpofut1表達下調。推測Atpofut1在植株中一定程度上參與抗逆抗病過程。

在某些處理條件下，Atpofut1的表達水平變化呈現出器官的特異性和時間的相關性。如高溫處理30 min時(圖6-B)，芽中Atpofut1表達顯著下調，而1 h后芽和根中的Atpofut1表達均上調。推測在30 min～1 h，植物通過調控Atpofut1的表達來調控關鍵蛋白活性，從而使植物應對高溫環境刺激。由此說明AtPOFUT1介導的O-巖藻糖基化在抗逆途徑中發揮關鍵作用。

2.5 AtPOFUT1的缺失對擬南芥種子發育的影響

除草劑篩選的陽性植株移栽培養后提取DNA進行三引物PCR的驗證。選取純合子植株收取種子用于后續表型觀測。

在相同條件下，種植純合子突變體和野生型種子，觀察幼苗表型發現突變體幼苗根形態正常，沒有異常卷曲及根毛過盛或偏少(圖7-A)，統計根長與野生型相比沒有顯著差異(圖7-B)，下胚軸在顯微鏡下觀察細胞形態與排列方式均與野生型相同(圖7-C)。

突變體成株生長周期與野生型均無明顯差異，花萼、花瓣、雌蕊、雄蕊等花結構完整，數量和形態均正常(圖7-D)，但是果莢較野生型弱小。統計果莢長度突變體顯著偏短，且有相當數量種子發育不良(圖7-E～G)。

3 結論與討論

本研究成功克隆了HsPOFUT1在擬南芥的同源基因Atpofut1，通過畢赤酵母異源表達獲得了有預期巖藻糖基轉移酶活性的重組蛋白AtPOFUT1。由此說明擬南芥中除了AtSPY這種植物特有的O-巖藻糖基轉移酶之外[18]，還具有與其他后生動物同源的POFUT1。與AtSPY不同的是，AtPOFUT1很可能與后生動物一樣，以含有EGF序列的蛋白作為底物[13]。雖然AtSPY與AtPOFUT1均具有O-巖藻糖基轉移酶活性，但由于底物特異性不同很可能介導不同的生物學過程，具有不同的生物學功能。后續工作中，O-巖藻糖基修飾蛋白組的檢測及相應底物譜的篩選研究對于揭示兩者功能的差異至關重要。

Atpofut1的轉錄組分析印證了植物會通過調控該基因的表達來調控關鍵蛋白活性從而使植物對各種脅迫環境做出應答。在植株的表型觀測中，與野生型相比，缺失Atpofut1的突變體幼苗發育、成株形態和花結構沒有顯著差異，但是存在果莢弱小、種子發育不良的特征。由于AtPOFUT1被證明在花粉管發育中有重要作用，種子和種皮的發育均與受精過程相關，該差異可能是由于授粉過程中花粉管發育不良造成的[19]。因此，Atpofut1不僅在脅迫環境下發揮作用，在生長發育中也有著非常關鍵的功能。O-巖藻糖基修飾蛋白組的篩選也能夠幫助分析Atpofut1在生長發育和脅迫環境下的信號轉導通路，進而揭示植物通過糖基化修飾調控生命活動的具體機制。