影響家畜耳型變異遺傳位點的研究進展

郭家中，鐘 杰，李鵬飛，李 利，張紅平

(四川農業大學 動物科技學院，成都 611130)

耳朵類型(簡稱耳型)是現代家畜品種的一個重要性狀，其主要包括耳朵(耳廓)大小、形狀和直立性三個方面的特征[1-2]。在一個家畜品種內，不同個體之間往往具有相同的耳型，且能夠穩定地遺傳；因此，耳型是家畜品種鑒定的理想表型指標之一。另外，近年來有關動物福利的研究結果表明，耳朵姿勢可作為動物情緒評估的重要依據[3-6]。

哺乳動物的耳朵包含內耳、中耳、外耳三部分；其中，外耳又分為外耳道與耳廓兩部分。一般而言，哺乳動物出生時，其耳朵形態與結構已基本形成[7]。以人耳為例，內耳、中耳、外耳依次在胚胎期第3、4、5周開始發育；其中，外耳耳廓最早發育成熟，到第20周時，已經具備成人耳廓的基本形態[8]。另外，內耳骨迷路于第23周發育完成，在前庭窗與鐙骨底板連接，完成內中耳的整合[9]；包含3個聽小骨(錘骨、砧骨、鐙骨)的中耳腔于第30周形成，并逐漸完成中外耳的整合[10-11]。如果與耳朵發育相關的基因發生突變，則可能會導致畸形耳。例如，周海梅等[12]總結了維甲酸和HOX基因家族對哺乳動物畸形耳的影響。但哺乳動物耳朵發育過程復雜，涉及多個基因，故影響不同家畜品種耳型變異的遺傳位點也不盡相同。本文總結歸納了影響豬、綿羊、山羊等家畜耳朵大小、外耳直立性以及小耳畸形等性狀遺傳位點的研究進展，旨在為家畜遺傳育種工作以及人類耳朵相關疾病研究提供參考。

1 影響豬耳型的遺傳位點

1.1 影響豬耳朵大小的遺傳位點

在養豬業中，大白、長白、杜洛克等著名的商業品種豬的耳型多為直立耳或前傾耳，而中國地方品種豬的耳型一般為長垂耳[13]。為探究影響家豬耳型變異的遺傳位點，Wei等[14]依據圖像信息，將大白豬和梅山豬雜交的F2代個體的耳朵分為大、中、小三類，最終在5號、7號染色體上分別鑒定到1個與耳朵大小和外耳直立性顯著關聯的數量性狀座位(quantitative trait loci，QTL)。Ma等[15]則利用圖像軟件準確測定了杜洛克和二花臉豬雜交的F2代個體豬耳面積，最終檢測到23個與耳朵質量、面積和直立性呈現顯著關聯的QTL；其中一個位于7號染色體58 cM區域的QTL與上述三個性狀顯著關聯，這與Wei等[14]的研究結果一致。基于此，Ren等[1]進一步利用同源相同(IBD)定位的方法將該QTL區間縮小至750 kb區域。相比較于該區域內其他8個候選基因，PPARD在皮膚穩態[16]和軟骨發育過程中[17]發揮重要作用，該基因的一個錯義突變(G>A，G32E)被確定是調控豬耳朵大小變異的一個因果突變。mRNA水平的基因表達量表明，G32E突變降低PPARD的表達，解除了PPARD對耳朵軟骨生長的抑制作用，從而間接促進耳朵過度生長，導致豬的耳朵變大[18]。綜上所述，PPARD被確定為首個影響家豬耳朵大小的基因(表1)。

表1 影響家畜不同耳型的遺傳位點Table 1 Genetic loci affecting different ear types in domestic animals

除上述7號染色體的QTL，多項研究表明，位于5號染色體30.14～40.92 Mb的基因組區域也是一個影響豬耳型變異的遺傳座位，但上述研究所報道的主效基因卻有差異[19, 22-24]。Li等[22]基于對HMGA2、SOX5、PTHLH這3個候選基因中7個SNPs位點的關聯分析，發現HMGA2的一個SNP位點(g.2836A>G)與耳朵大小相關性最高，從而將HMGA2確定為影響豬耳朵大小的基因。與之不同的是，Zhang等[24]基于對民豬(中國地方品種)和大白豬雜交的F2代資源群體的全基因組關聯分析(GWAS)結果，認為LEMD3和WIF1是影響豬耳朵大小的候選基因。進一步研究表明，WIF1的mRNA和蛋白表達量在60日齡大白豬中均顯著高于同日齡二花臉豬[19]。由于WIF1基因內的一個錯義突變(c.1167C>G)與豬耳朵大小顯著關聯[23]，因此，與HMGA2基因相比，WIF1更有可能是影響豬耳朵大小的一個候選基因。

此外，有研究表明，除基因點突變之外，拷貝數變異也會引起豬耳型變異。Chen等[20]鑒定到1個38.7 kb拷貝數變異(CNV)影響MSRB3基因的最后兩個外顯子，該變異僅在6個中國本土長垂耳豬和半垂耳豬中存在?；趀QTL分析的結果顯示，CNV與miR-584-5p的表達顯著關聯，而活體和離體的試驗又表明miR-584-5p會抑制MSRB3基因的mRNA翻譯，從而導致豬耳變大。這項深入系統的研究排除早前研究提出的與家豬耳朵大小相關的候選基因：HMGA2[22]、LEMD3、WIF1[19, 23-24]。與上述研究結果不同的是，Zhang等[21]發現MSRB3的mRNA表達量在60日齡的民豬中顯著高于同日齡的大白豬；并且表達量越高的個體，耳廓越大。蛋白水平的證據表明，MSRB3的表達量在60日齡二花臉豬中比同日齡大白豬更高[19]。總的來說，上述研究結果之間的差異可能是由不同的試驗動物或者不同的樣品采集時間引起的。因此，為進一步探究MSRB3是否在調控耳朵生長及發育過程中發揮作用，有必要深入研究在同一品種內，MSRB3的時間序列表達特征，從而深入理解該基因的功能。

1.2 控制豬耳畸形的遺傳位點

小耳畸形是一種先天性外耳畸形，具體表現為耳廓變小甚至外耳完全消失，從而導致聽力不同程度的喪失[39]。這種由小耳畸形導致的聽力喪失與內耳耳蝸中間細胞早期退化引起的聽力喪失不同[40]，但人們對其遺傳機制知之甚少。在人類上，患有小耳畸形的個體還表現出顱面畸形、小齒畸形、唇腭裂等[41]異常。該結果表明有些基因在胚胎發育早期發揮作用，不僅調控耳朵發育，而且也參與到其他組織器官的發育。

最近，Qiao等[25]利用GWAS分析在沙子嶺豬上揭示了HOXA1基因第一外顯子的一個突變(c.451delinsTC)使蛋白翻譯提前終止，導致HOXA1蛋白的核心結構域殘缺，從而引起豬的小耳畸形。Li等[26]利用基因編輯技術，以豬為模型模擬在人類中發現的TWIST2突變(p.E75K)[42]，所有基因編輯成功的個體均表現出小耳畸形。類似地，Hai等[43]構建了攜帶MITF突變(L247S)的巴馬香豬模型，該模型豬聽力損失特征與人類的聽力損失非常相似。上述研究表明，豬可以作為研究與人類耳朵發育異常相關疾病的模式動物。

2 影響綿羊耳型的遺傳位點

現有綿羊品種的耳型主要分為短直耳和長垂耳兩類，而中國地方綿羊品種的耳型多為長垂耳或半下垂耳[44]。綿羊耳型變異主要分為耳朵大小和形狀的變異；有趣的是，基于計算機斷層掃描獲取的外耳、中耳和內耳的解剖結構顯示，綿羊和人類的耳朵在結構上較為相似[45-46]。因此，綿羊耳朵可以作為人類耳朵相關醫學研究中的模型。

截至目前，共有7個與綿羊耳型變異相關的遺傳位點被報道[2, 27-29]?；陂L耳的多浪綿羊與短耳的迪慶綿羊的SNP芯片數據，Wei等[27]利用GWAS分析檢測到3號染色體上MSRB3基因內的一個SNP位點在兩個群體間表現出巨大的等位基因頻率差異，認為該位點與綿羊的耳朵大小關聯。最近，Gao等[2]利用一般線性模型和全基因組高效混合模型(GEMMA)，對耳朵大小不同的115只多浪綿羊進行GWAS分析，鑒定到DCC、PTPRD、SOX5共3個與綿羊耳朵大小顯著關聯的候選基因。

在綿羊小耳畸形方面，Jawasreh等[28]基于GWAS的研究表明，位于23號染色體GATA6基因上游的一個SNP位點是導致阿瓦西綿羊(Awassi sheep)小耳畸形的因果突變；這與GATA6基因調控脊椎動物軟骨組織發育的功能相一致[47]。Mastrangelo等[29]綜合利用GWAS和比較基因組學研究方法，確定1號染色體上CLRN1基因第3內含子區域的一個SNP位點(rs419889303)與貝里斯山谷綿羊(Valle del Belice sheep)小耳畸形顯著關聯。由于CLRN1是Usher綜合征(先天神經性耳聾)的致病基因之一[48]；因此，CLRN1被初步認為是引起綿羊耳朵畸形的一個候選基因[29]。最近，He等[30]采用病例-對照設計的GWAS研究，在畸形耳阿勒泰羊的HMX1基因增強子區域鑒定到一個 76 bp的片段重復，初步確定該變異與畸形耳性狀顯著關聯。

3 影響山羊耳型的遺傳位點

在全世界現有的山羊品種中，原產于非洲地區的山羊品種多為長垂耳類型；而亞洲地區的多為短直耳類型[44]。例如，中國成都麻羊、太行山羊、中衛山羊等地方品種[49]。總體而言，目前關于山羊耳型變異的遺傳研究相對較少。Kumar等[31]利用SNP芯片研究7個巴基斯坦本土山羊品種間的遺傳變異，發現MSRB3基因與山羊耳朵大小相關。Brito等[32]為鑒定控制拉曼查山羊短耳性狀的遺傳位點，將努比亞、波爾等長耳山羊品種作為對照，在全基因組水平檢測到7號染色體的48.5～57.3 Mb區域最有可能與山羊短耳性狀關聯；雖然該區域內存在CXCL14、POU4F3、NDST1等與耳朵發育相關的基因[32]，但因果突變尚未被確定。最近，鐘杰等[33]在西藏仲巴縣帕江鄉的藏山羊群體中，發現部分山羊的耳朵發育不完全、外耳較小，總體上與拉曼查山羊的耳型相似；比較基因組學分析結果顯示，7號染色體45.05～59.76 Mb區域在正常耳和小耳型藏山羊之間存在顯著的遺傳分化；這與Brito等[32]在拉曼查山羊上的研究結果一致。簡言之，上述研究初步表明，該基因組區域是影響山羊耳型變異的一個遺傳位點。

4 影響其他家養動物耳型的遺傳位點

關于耳型變異的遺傳位點在其他家養動物中亦有報道。例如，Boyko等[34]利用915只家犬(80個品種)、83只灰狼、10只非洲犬的基因組芯片數據以及57個性狀的表型數據，開展GWAS研究；最終確定MSRB3基因上游100 kb區域與家犬的垂耳表型顯著關聯。Vaysse等[35]基于12個直立耳和15個垂耳家犬品種的GWAS分析，鑒定到23個SNPs位點與垂耳表型顯著關聯，其中最顯著的SNP位于HGMA2與MSRB3基因之間。近年來，Webster等[36]對46個不同耳型的家犬品種進行了GWAS分析，同樣鑒定到該位點與垂耳表型關聯。綜上所述，MSRB3所在基因組區域是影響家犬耳型變異的遺傳座位。馬作為最早被人類馴化的動物之一，如今已經形成了多個品種[50]。原產于印度的馬瓦里馬(Marwari horse)是一種耳朵直立，耳尖向內翻卷的特殊品種[51]；Jun等[37]在該品種中檢測到TSHZ1基因的一個錯義突變(p.Ala344>Val)與馬瓦里馬耳尖向內翻卷有關。雖然已有TSHZ1基因缺陷導致小鼠中耳畸形的報道[52]，但Jun等的研究僅使用了1個樣本，結果的準確性有待在更大的樣本群體中驗證。在牛上，部分瑞士高原牛的外耳表現出鋸齒狀耳廓或耳廓縮短等畸形特征。Koch等[38]基于GWAS分析，首先將因果突變定位于6號染色體的4 Mb區域內，進一步依據全基因組重測序的數據，確定該區域內HMX1基因下游發生的CNV是因果突變，這與阿勒泰羊畸形耳的形成原因一致[30]。

5 小 結

盡管從分子機制角度，耳朵的生長發育過程受到多基因協同調控，但基于全基因組水平的研究結果表明，影響家畜耳型變異的候選基因主要包括MSRB3[14-15, 19-21, 27, 31, 34-36]、PPARD[1, 14-15, 18]、HMX1[30, 38]等。尤其是，MSRB3在豬、綿羊、山羊、犬上均有報道；最近，Mastrangelo等[53]的研究表明，MSRB3基因變異與綿羊的脂肪沉積相關。因此，可以推測該基因變異導致脂肪沉積過程異常，從而造成家畜耳朵變大、下垂。

總體來說，借助全基因組遺傳多態性數據以及基因表達數據，現有研究鑒定到多個影響家畜耳型變異的遺傳座位，增強人們對家畜耳朵發育機制的理解。盡管如此，上述研究仍存在諸多分歧。例如，對于耳型屬于質量性狀還是數量性狀尚無定論；在一些研究中，耳型被視作質量性狀[27, 31-32, 34]，簡單地劃分為三類(大、中、小)。顯然，利用定量手段準確測定耳朵的面積則有利于提高分析的準確性。因此，一些研究利用圖像處理軟件等工具準確測定家畜(例如，豬)耳面積，將其作為數量性狀進行分析[1, 15, 18, 20, 22]。另外，有些研究使用的樣本量太少，相關結果需要在更大的樣本群體中進行驗證。同時，在已有研究中，人們針對耳朵大小、直立性等性狀分別進行統計分析；但考慮到這些性狀間的遺傳相關，采用多性狀統計分析模型理論上更為合理。此外，甲基化測序、三維基因組(例如，Hi-C)等系統性研究技術的應用，將會提高因果突變的鑒定及分子機制研究的準確性和效率。因此，綜合運用現代遺傳學的各種方法和技術，將有助于全面解析家畜耳型變異機制，從而為家養動物遺傳育種工作以及人類耳朵相關疾病研究提供參考。