慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清HBV基因型分析*

宋金云，王建芳，趙宏宇

乙型肝炎病毒(HBV)是一種部分雙鏈環狀DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科，其基因組結構獨特而精密，全長約3.2 kb，包含4個開放性讀碼框，即S區、C區、P區和X區，分別編碼外膜蛋白、核心蛋白、聚合酶和X蛋白。HBV感染呈世界性流行，雖然有高效的乙肝疫苗接種計劃，但HBV感染仍然是一個嚴重的公共衛生問題，是全球慢性肝病和死亡的重要原因[1,2]。慢性HBV感染者有著不同的臨床表型，包括無癥狀攜帶狀態、急性肝炎、暴發性肝炎(肝衰竭)、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌[3]。影響HBV感染臨床進程和預后的因素有HBV基因型、HBV DNA水平、特異性病毒突變、宿主的遺傳特征和環境因素等。其中，HBV基因型是決定慢性HBV感染者臨床預后的一個重要因素。同時，HBV基因型也可能影響對聚乙二醇干擾素α的治療應答和HBeAg血清轉換[4]。本研究對295例慢性HBV感染者進行了HBV基因分型，以探討它們與臨床表型和預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 295例HBV感染者血清來自2015年6月～2018年5月南京中醫藥大學附屬南京市第二醫院，其中慢性乙型肝炎261例，男112例，女149例，平均年齡為30.2±14.6歲；肝硬化30例，男21例，女9例，平均年齡為44.6±11.2歲；肝細胞癌4例，男3例，女1例，平均年齡為56.0±8.6歲。入選患者診斷符合2015年發布的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標準[5]，所有患者均未接受過核苷(酸)類似物或α-干擾素治療，排除合并其他肝炎病毒感染、藥物性、自身免疫性和酒精性肝病。本研究經南京中醫藥大學附屬南京市第二醫院醫學倫理學委員會批準(意見號：2019-LY-kt089)，患者簽署知情同意書。

1.2 HBV基因分型 采用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Germany)提取血清DNA。設計上游引物 5’-AGGCGGGGTTTTTCTTGTTGAC-3’(sense 201-222 )和下游引物 5’-AAAGGGACTCAAGATGTTGTAC-3’(antisense 790-769)，擴增HBV DNA S區內的590 bp片段。PCR 擴增條件：94℃預變性 3 min，94℃ 變性 30 s，58℃ 退火45 s，72℃ 延伸 45 s，32個循環，最后 72℃ 延伸10 min。PCR 擴增后，采用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Germany) 純化PCR 產物，使用BigDye Terminator v3.1cycle sequencing kit(Applied Biosystems)在ABI PRISM 3100 Genetic Analyze上直接對純化的PCR產物進行測序。對獲得的測序序列經NCBI網站分型窗口(http://www.nvbi.nlm.gov/projects/genotyping/formp age.cgi )進行HBV基因分型。

1.3 血清檢測 使用i2000型化學發光免疫分析儀及其配套試劑盒(定標品和質控品為試劑盒自帶，美國雅培公司)檢查血清HBV標記物(HBsAg ≥ 0.05 IU/mL、HBsAb ≥ 10 mIU/mL、HBeAg ≥1.0S/CO、HBeAb≤ 1.0 S/CO和HBcAb ≥1.0 S/CO判為陽性)；使用日立7600-120全自動生化分析儀測定血生化指標；采用放射免疫法檢測血清透明質酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、IV型膠原(CIV)和III型前膠原N端肽(PIIINP)；使用ABI7300熒光定量PCR檢測儀(美國應用生物公司)和 HBV DNA定量檢測試劑盒(深圳匹基生物工程有限公司)檢測血清HBV DNA(檢測范圍為500 IU/mL～1×108IU/mL。當HBV DNA≥500 IU/mL時，按實際檢測結果計算，當其<500 IU/mL時，均報告為小于最低檢測線)。

2 結果

2.1 不同血清標志物陽性患者HBV基因分型情況 在295例HBV感染患者中，有132例(44.7%)為B型感染，161例(54.6%)為C型感染，2例(0.7%)為D型感染。7種不同HBV血清學標志物陽性患者HBV基因分型情況見表1。

表1 不同血清HBV標記物陽性患者HBV B型和C型流行率(%)比較

2.2 慢性乙型肝炎和肝硬化患者實驗室指標比較 慢性乙型肝炎患者與肝硬化患者血清TBIL、ALT和AST水平比較差異均無統計學意義(P>0.05，表2)；肝硬化患者血清肝纖維化指標顯著高于慢性乙型肝炎患者(P<0.05)；肝硬化患者血清HBV DNA載量顯著高于慢性乙型肝炎患者(P<0.05)，血清HBeAg陽性率顯著高于慢性乙型肝炎患者，差異具有統計學意義(x2=5.798，P<0.05，表2)。

2.3 不同臨床表型患者HBV基因型比較 在295例HBV感染者中，慢性乙型肝炎261例，肝硬化30例，肝細胞癌4例。肝硬化患者和肝細胞癌患者C型比例顯著高于慢性乙型肝炎患者，差異具有統計學意義(P<0.05，表3)。

表2 慢性乙型肝炎和肝硬化患者實驗室指標比較

表3 不同臨床表型患者HBV基因型構成比(%)比較

3 討論

乙型病毒性肝炎呈全球性分布，是嚴重危害人類身體健康的傳染性疾病。在我國，HBV感染尤為突出，肝硬化和肝癌大部分與慢性HBV感染有關，給社會和經濟生活帶來嚴重負擔。多種因素影響HBV感染后的臨床轉歸，HBV基因型可能是其中重要的因素之一，與臨床預后密切相關，且不同基因型具有不同的致病性[6]。隨著精準醫療和分子生物學技術的迅猛發展，人們越來越認識到HBV基因分型的臨床重要性，對HBV基因型的研究也越來越深入。根據HBV核苷酸全序列異質性≥8%或S基因序列≥4%，可將HBV分為10個基因型，包括A型、B型、C型、D型、E型、F型、G型、H型、I型和J型[7]。大量研究表明，HBV基因型分布具有明顯的地理區域性差異，A型流行于北歐、非洲和印度，B型和C型主要分布在中國、韓國和東南亞，D型主要在歐洲、北非、俄羅斯、中東和印度次大陸流行，E型、F型、G型、H型、I型和J型主要發現于西非、中美洲和南美洲、美國、中美洲、越南和日本[8]。我國HBV基因型主要以B型和C型為主，這兩種基因型的慢性肝病患者病情嚴重程度各不相同，多數研究結果顯示C型患者比B型患者具有更為嚴重的肝損傷，C型患者更容易發生晚期纖維化、肝硬化和肝癌[9-11]。

本研究通過對295例HBV感染患者血清病毒基因型分析，發現B型有132例，占44.7%；C型有161例，占54.6%；D型有2例，占0.7%，說明HBV基因型以B型和C型為主，且C型略高于B型。HBsAb作為一種保護性抗體，可中和HBsAg。血清HBsAb陽性意味著對HBV有免疫力。一般情況下，HBsAg和HBsAb不會同時出現陽性，但在實際臨床工作中還是發現一部分患者血清標志物HBsAg和HBsAb同時陽性的現象。本組295例HBV患者中有七種HBV血清學標志物陽性組成模式，模式1和模式2是HBV感染患者最常見的血清學標志物陽性組成模式。在模式3和模式4中出現了HBsAg和HBsAb同時陽性的現象，可能由于不同亞型感染或者S基因氨基酸序列發生突變形成免疫逃逸或免疫耐受[12]。

肝纖維化是慢性肝炎發展成肝硬化的必經階段。有研究顯示肝纖維化的長期持續發展可導致肝硬化和肝癌[13,14]。HA，LN，CIV和PIIINP是與肝臟炎癥嚴重程度相關的四個肝纖維化血清標志物，可以反映膠原合成狀態，是臨床上對肝纖維化有較高診斷價值的參考指標[15]。HA為高分子多糖，由肝內間質細胞合成，是構成肝細胞外基質的主要成分，在肝臟慢性炎癥過程中，HA合成增多，而肝細胞對HA的降解能力降低。LN是非膠原性結構蛋白，是基底膜的主要成分之一，主要由肝臟內皮細胞合成，可以反映肝纖維化的進展和嚴重程度。CIV是一種纖維狀糖蛋白，是構成基底膜的重要成分，當基底膜遭受破壞時，CIV明顯增加，可較靈敏地反映出肝纖維化過程。PIIINP是III型前膠原分泌到細胞外被肽酶切下的N端肽，能特異地反映III型前膠原的代謝水平，敏感地提示肝內纖維化程度。本研發現肝硬化患者血清HA、LN、CIV和PIIINP水平均顯著高于慢性乙型肝炎患者(P<0.05)。

HBV DNA 和HBeAg 分別是衡量HBV復制能力和傳染性的主要病毒學和血清學指標[16,17]，兩者是評估HBV感染患者體內病毒感染狀況、病情進展和預后的重要指標。HBV持續復制和肝臟炎性壞死是肝炎肝硬化病情進展的主要決定性因素。目前，普遍認為C型比B型感染者HBeAg陽性率更高，引起的肝臟炎性壞死更嚴重，且C型與肝硬化和肝細胞癌相關，可能與C型HBV復制能力和變異能力較強，能夠逃避宿主免疫攻擊和藥物雙重壓力，從而維持持久的病毒血癥有關。本研究結果顯示，肝硬化患者血清HBV DNA載量為(6.4±1.8) lg copies/ml，HBeAg陽性率為90.0%(27/30)，顯著高于慢性乙型肝炎患者，差異具有顯著性(P<0.05)。在295例HBV感染者中，肝硬化和肝細胞癌共有34例，慢性乙型肝炎有261例，肝硬化患者和肝細胞癌患者中C型感染所占比例分別為73.3%(22/30)和75%(3/4)，均高于慢性乙型肝炎患者的52.1%(136/261)，差異具有統計學意義(P<0.05)。這些數據表明C型感染患者比B型患者更容易出現嚴重的肝臟炎癥和組織損傷，預后更差，與既往大多數研究結果一致[18-20]。

HBV基因型與慢性乙型肝炎、肝硬化和肝細胞癌的發展、治療療效和臨床轉歸相關。本文結果表明，慢性乙型肝炎和肝硬化患者感染HBV基因型以B型和C型為主，以C型居多。C型感染患者比B型感染患者更容易出現嚴重的肝損傷，并產生不良的臨床結局。本研究有助于更好地了解HBV基因型分布，為HBV相關肝病的防治提供臨床流行病學數據，為指導臨床對乙型肝炎進展的判斷和臨床用藥提供依據。