缺氧誘導因子-1α參與肝纖維化形成機制研究進展*

劉瑞清 綜述，袁小澎 審校

1 肝纖維化

肝纖維化是所有慢性肝病所經歷的共同中間途徑，在酒精、病毒和遺傳性疾病等多種因素作用下，在肝細胞損傷修復的過程中伴隨著損傷修復慢性化，導致纖維化的發(fā)生。伴隨膠原蛋白和細胞外基質(ECM)的沉積[1]，導致肝硬化。肝星狀細胞(HSC)的活化在上述過程中起著十分關鍵的作用[2]。當HSC活化后，除了自身分泌作用外，還發(fā)揮調節(jié)細胞外基質和調節(jié)肝臟生長和修復平衡的作用[3]，成為纖維化進程中的關鍵細胞。HSC活化受到多種促纖維化介質的調節(jié)，在調節(jié)這些介質的產生過程中，HIF-1α起著十分重要的作用[4]。

2 HIF-1α

2.1 HIF-1α結構 HIF-1α是缺氧誘導因子-1(HIF-1)的組成部分，α亞基(通常為HIF-1α或HIF-2α)與β亞基(HIF-1β也稱為芳基烴受體核轉位蛋白)一起組成HIF-1。HIF-1α是HIF-1的調節(jié)亞基，是主要的功能亞基，對HIF-1的轉錄活性起著關鍵性作用。在常氧條件和沒有其他代謝紊亂的情況下，HIF的α亞基被脯氨酰-羥化酶(PHD1，PHD2或PHD3)快速羥基化，進而被蛋白酶體降解。因此，在常氧狀態(tài)下HIF-1α的含量極低[5]。在缺氧條件下，HIF-1α降解受阻，被運輸到細胞核內，在核內聚集，與HIF-1β形成二聚體，進而通過與缺氧反應元件(HRE)結合而促進下游靶基因轉錄生成多種蛋白質產物，發(fā)揮多種生物學功能[6]。

2.2 HIF-1α與肝損傷 研究表明，在使用乙醇、對乙酰氨基酚(APAP)和四氯化碳(CCL4)誘導的肝纖維化模型小鼠，HIF-1α均能被檢測到高表達。在APAP誘導的肝損傷模型，HIF-1α缺陷能夠使得小鼠在6小時內免受APAP肝毒性作用，并且降低肝組織中性粒細胞積累和血漿白細胞介素-6水平，調節(jié)正常T細胞表達和分泌，改善APAP刺激后的炎癥反應[7]。在膽管結扎(BDL)肝纖維化小鼠中，相較于對照模型組，HIF-1α缺陷能夠使得小鼠肝組織I型膠原(Collagen I)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)mRNA和蛋白質水平減少，血小板衍生生長因子(PGDF)和纖溶酶原激活物抑制物-1 mRNA水平亦明顯減少[4]。體外實驗表明，缺氧能夠激活HIF-1α調節(jié)基因的表達，而這些基因可能改變HSC對某些激活劑和趨化因子的敏感性，并調節(jié)血管生成和膠原合成重要的基因表達[8]。

3 HIF-1α與肝纖維化相關信號通路

3.1 HIF-1α/TGF-β1與HIF-1α/VEGF信號通路 轉化生長因子β1(TGF-β1)是免疫反應、炎癥、基質合成、細胞生長、細胞凋亡和分化等許多領域的必需介質，亦是參與肝纖維化過程的主要促纖維化細胞因子。相關研究已經證實，抑制TGF-β1表達和調節(jié)TGF-β-Smad信號通路是預防肝纖維化的有效方法[9]。在胚胎中的器官生長和成年人受傷組織的修復過程中，血管將氧氣運送到遠處的器官，促進血管生長，發(fā)揮至關重要的作用。當血管生長不平衡時，則會導致許多疾病的發(fā)病[10]。血管內皮生長因子(VEGF)具有促進不同來源內皮細胞分裂、增殖和血管構建的作用, 能促進內皮細胞、單核細胞的遷移，誘導血管生成，在新生血管生成過程中起著十分重要的作用[11]。相關研究表明，兩種人正常肝細胞系：QSG-7701和L02細胞，在缺氧培養(yǎng)6小時后，HIF-1α、TGF-β1和VEGF表達表現出增加趨勢，并在24小時達到較高水平。當予以序列特異性siRNA對HIF-1α表達進行抑制后，能夠顯著降低缺氧肝細胞中TGF-β1和VEGF的表達，表明TGF-β1和VEGF可能是HIF-1α的潛在靶基因。此外，在細胞培養(yǎng)基內的TGF-β1和VEGF表達也與細胞內表達趨勢相同，并且也在HIF-1α被抑制后表達降低。將培養(yǎng)缺氧肝細胞的上清液添加到HSC細胞培養(yǎng)基中可以增強缺氧誘導的HSC活化，也即表明，在低氧狀態(tài)下HIF-1α能夠誘導VEGF和TGF-β1表達增加，進一步誘導并增強HSC的活化，從而促進肝纖維化的發(fā)展[12]。HIF-1α還能協(xié)同其他基因增強對VEGF表達的誘導作用。例如，單獨轉染Osx或HIF-1α可分別使VEGF啟動子活性增加3.6倍和3.3倍。當共轉染同等量的Osx和HIF-1α時，可協(xié)同作用使VEGF啟動子活性增強9.3倍[13]；E2F7/8與HIF1能夠形成轉錄復合物以刺激VEGFA啟動子活性[14]；缺氧時，HIF-1α和信號轉導子和轉錄激活因子3(STAT3)形成轉錄復合物，調節(jié)HepG2細胞VEGF的表達[15]。因此，研究證據表明，HIF-1α能夠與VEGF直接相互作用，即VEGF可能是HIF-1α的直接靶基因。

二甲雙胍通過抑制HIF-1α能抑制VEGF的表達，抑制基于HSC的血管生成，抑制纖維化的進展[16, 17]。塞來昔布聯(lián)合奧曲肽能夠通過抑制肝內和肝外血管生成，協(xié)同改善誘導大鼠的肝纖維化和門靜脈高壓，其機制可能與p-ERK-HIF-1a-VEGF信號傳導途徑失活有關，表明HIF-1α與VEGF的信號通路還受上游信號的調控[18]。因此，針對HIF-1α有抑制作用的藥物一方面能夠抑制TGF-β1的表達，進而抑制TGF-β1誘導的HSC活化等下游反應；另一方面，能抑制VEGF的表達，抑制血管生成，進而影響肝纖維化形成或進一步發(fā)展為肝癌。

3.2 HIF-1α誘導細胞自噬相關通路 細胞自噬是細胞內降解過程，其中溶酶體降解蛋白質、細胞器和入侵的微生物[19]，通常由缺氧或饑餓激活[20]。在缺氧條件下，對LX-2細胞予以siRNA使HIF-1α的表達減少后，能夠使與細胞自噬相關蛋白LC3B-II和Beclin-1表達減少。當對LX-2細胞予以脂多糖(LPS)刺激時，能夠誘導其自噬活性、HSC活化以及HIF-1α的積累增加，表明除了缺氧條件下，在炎癥微環(huán)境下細胞自噬和HIF-1α增加也是HSCs活化的重要機制[20]。細胞自噬與HIF-1α的積累相關。因此，抑制HIF-1α的產生或增加HIF-1α的降解能夠使細胞自噬過程得到抑制，進而抑制HSC的活化過程。H3K4me3，即組蛋白第三亞基四號賴氨酸的三甲基化，是染色質中組蛋白甲基化修飾的重要標記，參與基因表達的激活。缺氧能夠誘導細胞的H3K4me3組蛋白甲基化修飾[21]。當對LX-2細胞予以二氯化鈷(CoCl2)誘導后，HIF-1α和H3K4me3逐漸增加，且免疫共沉淀表明缺氧LX-2細胞HIF-1α轉錄復合物H3K4me3組蛋白發(fā)生甲基化修飾，故抑制組蛋白甲基化修飾能夠使缺氧誘導的細胞自噬受到抑制，從而抑制HIF-1α通過自噬誘導的HSC活化。此外，CoCl2誘導缺氧導致HIF-1α核轉運，抑制組蛋白甲基化修飾可抑制HIF-1α的核轉位，表明組蛋白甲基化在HIF-1α核轉運中亦起重要作用[22]。甲基硫腺苷能夠抑制組蛋白甲基化修飾[23]，從而影響HIF-1α誘導的細胞自噬和HSCs活化，抑制肝纖維化進程，但由于組蛋白甲基化修飾涉及其他基因的調節(jié)作用，故抑制此過程的負向作用也有待進一步研究。

4 HIF-1α表達相關信號通路

4.1 HIF-1α/ mTOR通路 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路調節(jié)許多重要細胞過程，在生長和分裂細胞的基礎生理學中起到了核心作用[24]。mTOR信號傳導對于HSC的激活至關重要，為纖維化肝臟中ECM的關鍵來源。西羅莫司(雷帕霉素)和依維莫司作為mTOR的抑制劑，可顯著降低纖維化率達70%，在CCL4肝纖維化模型大鼠，HIF-1α以及p-mTOR(mTOR的活性形式)表達量明顯增高，當予以一種能減輕肝纖維化的中藥成分芍藥甙干預時，兩者表達均明顯減少[25]。在低氧條件下，HSCs中的p-mTOR水平顯著增加，當予以mTOR抑制劑后，能夠降低HIF-1α和VEGF表達，從而抑制HIF-1α和VEGF導致的血管生成及纖維化進展[16]。mTOR抑制劑能夠減輕纖維化，并且能夠抑制HIF-1α的相關作用機制。因此，通過抑制mTOR/HIF-1α通路抑制肝纖維化進程具有可行性，但由于mTOR涉及較多正常細胞生理過程，當其受到抑制時，是否會有其他嚴重的不良反應還有待探究。

4.2 HIF-1α/ NF-κB通路 核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(NF-κB)是轉錄因子家族的總稱，是調控HIF-1α轉錄的重要因子。研究表明，缺氧狀態(tài)下，HIF被激活，可以進一步促進NF-κB亞基向核的轉運，從而導致炎癥反應加重，而NF-κB可反饋性調節(jié)HIF-1α轉錄，增加其表達[26]。但研究表明，NF-κB可能具有促纖維化和抗纖維化的雙重作用，其抗纖維化的作用可能與抑制Collagen I基因表達有關。因此，在纖維化進程中，NF-κB活化能夠促進HIF-1α的積累，同時具有一定的抗纖維化活性[27]，故通過抑制NF-κB活性來抑制HIF-1α的積累可能涉及到促纖維化與抗纖維化的平衡，具有雙面性。

4.3 HIF-1α/ERK通路 細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成員，為信號轉導蛋白，正常定位于胞漿，當激活后轉位至胞核，調節(jié)轉錄因子活性，產生細胞效應。ERK家族包括ERK1和ERK2，調節(jié)細胞許多重要生理作用。研究表明，在缺氧條件下，ERK1/2信號通路能夠提高HIF-1的活性[28]。此外，抑制MAPK磷酸化能夠增強HIF-1α泛素化，并抑制HIF-1α易位進入細胞核[29]。研究發(fā)現，核HIF-1α蛋白存在于肝硬化患者肝臟的巨噬細胞、肝細胞和成纖維細胞，是巨噬細胞產生促纖維化介質的重要調節(jié)因子[30]。肝纖維化大鼠HIF-1α和p-ERK表達升高，予以姜黃素處理后能夠使HIF1α和p-ERK表達降低，大鼠纖維化程度減輕，表明HIF-1α可能至少部分通過ERK途徑促進肝纖維化[31]。因此，通過抑制ERK通路可能抑制HIF-1α的活性或核轉運，對纖維化程度起到一定程度的抑制作用。

5 HIF-1α降解相關信號通路

5.1 HIF-1α/琥珀酸信號通路 檸檬酸循環(huán)(CAC)是需氧生物體內普遍存在的代謝途徑，分布在線粒體。研究表明，在缺血再灌注損傷時，檸檬酸循環(huán)的中間體琥珀酸的異常積累會作為一種代謝信號誘導活性氧簇(ROS)產生[32]。在關于非酒精性脂肪性肝炎的研究中發(fā)現，琥珀酸能夠誘導促纖維化因子TGF-β1、α-SMA和IL-1β表達，而上述因子能夠進一步誘導活化HSC。當對HIF-1α基因進行敲低處理后，上述因子表達減少；反之，當予以HIF-1α活化劑CoCl2后，上述因子的表達增多，表明HIF-1α是琥珀酸鹽誘導炎癥和激活HSC這一過程必需的因子[33]。在有氧狀態(tài)下，HIF-1α能夠不斷合成，又迅速被PHD降解。因此，PHD受損是HIF-1α積累的主要原因[34]。琥珀酸能夠抑制HSC中PHDs活性，使HIF-1α的羥基化受損，保持HIF-1α的穩(wěn)態(tài)進而導致HIF-1α積累。在巨噬細胞中，琥珀酸鹽還能通過削弱PHD活性來誘導ROS的發(fā)生進而誘導HIF-1α積累[35]。

5.2 HIF-1α與VHL通路 von-Hippel-Lindau蛋白(VHL)是HIF-1α與HIF-2α的重要調節(jié)因子，常氧細胞中VHL的失活會導致HIF積累活化，表明VHL是HIF降解所必需的重要因子，VHL蛋白還可調節(jié)許多器官與細胞的纖維化過程。在肝組織，肝細胞VHL的條件性失活可導致肝臟炎癥和肝臟脂肪變性。人類丙型肝炎、酒精性和膽汁淤積性肝硬化患者肝組織VHL表達受到顯著抑制，并同時伴隨著HIF-1α和HIF-2α的積累。在動物實驗中，VHL過表達可以減輕模型小鼠肝纖維化。當特殊不易降解的活性HIF-1α或HIF-2α存在時，纖維化的改善效果將會減弱，表明VHL調節(jié)纖維化的過程依賴HIF-1α和HIF-2α。值得注意的是，在BDL小鼠，單獨沉默HIF-1α或HIF-2α可抑制肝纖維化，同時沉默HIF-1α和HIF-2α可進一步減弱纖維化；在CCl4組模型小鼠，單獨沉默HIF-2α對減輕肝纖維化的作用更加顯著，表明HIF-2α可能在病毒性肝纖維化病變起主導作用[36]。

5.3 HIF-1α/YAP通路 HIF-1α在缺氧條件下的積累可以誘導下游靶基因如VEGF-A和血管生成素-2(Ang-2)的轉錄和釋放，進一步促進未成熟血管生成，阻止血竇和肝細胞之間的營養(yǎng)轉運，加重肝細胞損傷[37]。肝竇內皮細胞(LSECs)在包括肝纖維化的慢性肝病的發(fā)生和發(fā)展中起關鍵作用[38]。當予以HIF-1α的抑制劑ACF時能夠降低LSEC中缺氧誘導的VEGF-A和CD31的表達升高，表明HIF-1α與VEGF和CD31的表達有關。YAP作為致癌基因能夠影響細胞增殖、衰老、化學抗性和血管生成。當予以YAP siRNA后，抑制了YAP的表達，同時VEGF-A和CD31的表達降低，予以YAP質粒使其表達增加時則使VEGF-A和CD31的表達增高。兩部分結果表明YAP可能通過促進HIF-1α在LSEC中的積累而發(fā)揮促血管生成作用。但另有研究表明，YAP的干預不能顯著改變HIF-1αmRNA水平，可能由于YAP通過控制蛋白酶體介導的HIF-1α降解過程來影響HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性，但不影響HIF-1α的基因轉錄[37,39]。YAP/HIF-1α通路與HIF-1α的降解相關，故可考慮研究使相關的蛋白酶體失活或者阻斷YAP的相應受體從而減輕HIF-1α的積累，促進其正常降解，進而減輕肝纖維化進程。