310例中國人基因組干擾素α1/α2基因多態性研究

王 兵，盛 海，盧 晨，程聯勝，龔慶國

干擾素(interferons，IFNs)是一類具有抗病毒、抗增殖和免疫調節活性的細胞因子家族[1]，誘導同種細胞產生抗病毒蛋白，建立抗病毒應答，限制病毒的進一步復制和擴散，是機體天然免疫系統的關鍵組成部分[2,3]，臨床上廣泛用于治療各種病毒感染性疾病。α-干擾素是臨床上治療慢性乙型肝炎(CHB)和慢性丙型肝炎(CHC)的一線用藥，以往研究表明由于人體缺乏IFNα2a基因[4]，導致這類人群在應用IFNα2a后抗IFNα2a抗體產生率較高而影響藥物的治療療效[5，6]。由于缺少大樣本中國人群干擾素基因型分布的基礎研究以及僅我國批準了IFNα1b上市，因此有學者認為IFNα1b來源于中國人臍帶血白細胞，而IFNα2a和IFNα2b來源于西方白種人[7]，從而錯誤解讀為IFNα1b屬于中國人基因，IFNα2a和IFNα2b為外國人基因。為了徹底探明中國人群IFNα1和IFNα2基因的遺傳背景，為臨床用藥提供參考，我們檢索了千人基因組數據庫上收錄的中國人IFNα1和α2基因單核苷酸位點多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)，現將結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究人群 選擇千人基因組數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)公布的2535例全人類雙倍染色體基因組序列，其中有310例為中國人雙倍染色體基因組序列。在這310例中國人中，男性147例，女性163例。包括北京漢族人(Han Chinese in Bejing, China)103例，南方漢族人(Southern Han Chinese)108例，西雙版納傣族人(Chinese Dai in Xishuangbanna,China)99例。

1.2 研究基因 干擾素α1基因(IFNA1)和干擾素α2基因(IFNA2)基因位于人類第9號染色體短臂[8]，基因IFNA1具體位置為Chr9: 21,440,453-21,441,315，全長863 bp，編碼區為567 bp；基因IFNA2具體位置為Chr9: 21,384,254-21,385,396，全長1142 bp，編碼區為564 bp。兩個基因均包含5’-端非編碼區(5’-UTR)、編碼區(coding)和3’-端非編碼區(3’-UTR)三個部分，其中編碼區還包含信號肽區和成熟蛋白區。編碼區突變的結果會造成起始缺失變異體(start_lost)、錯義突變體(missense_variant)、同義突變體(synonymous_variant)、終止密碼子突變(stop_gained)和插入/缺失性移碼變異體(frame shift_variant)和終止子缺失變異體(stop_lost)等。本研究意在檢索千人基因組數據庫收錄的310例中國人IFNA1和IFNA2基因引起成熟蛋白編碼區出現錯義突變體、移碼變異體、終止密碼子和和終止子缺失變異體的SNP位點。

1.3IFNA1/IFNA2等位基因 根據IFNA1和IFNA2基因成熟蛋白編碼區的差異，迄今為止的文獻報道，從人類細胞中克隆的IFNA1有三個等位基因，分別為IFNα1、IFNαD和IFNα1/158Val[9]。IFNα1是由Goeddel et al于1981年從人胎肝染色體基因文庫中分離得到的[10]。 IFNαD與IFNα1僅有一個氨基酸的差異，其成熟蛋白114位的氨基酸殘基由IFNα1的丙氨酸(Ala)突變為纈氨酸(Val)。IFNαD基因是Nagata et al于1980年從急性髓性白血病細胞系(KG-1)cDNA中克隆的[11]。IFNα1/158Val基因由我國學者黎孟楓等人于1991年從中國漢族人胎肝染色體中克隆的[9]，其成熟蛋白158位的氨基酸殘基由亮氨酸(Leu)突變為纈氨酸。依據《中國藥典》三部注釋(2015年版)第212頁載明的IFNα1b蛋白一級氨基酸序列，IFNα1b與IFNα1存在三個氨基酸序列的差異，分別為成熟蛋白第58位谷氨酰胺(Gln)突變成組氨酸(His)、第100位的纈氨酸突變成丙氨酸和第149位的纈氨酸突變成甲硫氨酸(Met)。所以，編碼IFNα1b的基因也可以書寫為IFNα1 (Gln58His、Val100Ala、Val149Met)。同樣，報道顯示人類IFNA2也有三個等位基因，分別為IFNα2a、IFNα2b和IFNα2c。IFNα2b基因由美國學者Streuli et al于1980年從健康人外周血白細胞中克隆[12]，IFNα2a基因由美國學者Goeddel于1980年在急性髓系白血病細胞系(KG-1)cDNA中克隆的[13]，其成熟蛋白第23位的氨基酸殘基由IFNα2b的精氨酸(Arg)突變為賴氨酸(Lys)。IFNα2c基因于1985年由美國學者BODO從Namalwa類淋巴母細胞系中克隆[14]，其成熟蛋白第34位的氨基酸殘基由組氨酸突變為精氨酸。

1.4 研究方法 首先，在Pubvar網站(https://www.pubvar.com)，在單核苷酸多態性數據庫(single nucleotide polymorphism database, dbSNP，)中，查詢IFNA1和IFNA2基因成熟蛋白編碼區形成錯義突變體、移碼突變體、終止密碼子和終止子缺失變異體的單核苷酸多態性位點。然后，在千人基因組數據庫瀏覽器(1000 genome browser)查詢310例中國人這些單核苷酸多態性位點的突變情況。記錄各種SNP位點的發生人數并計算相應等位基因頻率， 并將中國人群IFNA1和IFNA2優勢等位基因頻率與日本、越南、非洲或非洲裔、南亞或南亞裔、歐洲或歐洲裔和美洲地區人群進行比較分析。

2 結果

2.1IFNA1和IFNA2非同義突變SNP位點 在千人基因組數據庫收錄的2535個人群中，IFNA1基因成熟蛋白編碼區有5個SNP位點出現錯義突變，無移碼變異體、終止密碼子和和終止子缺失變異體的SNP位點。IFNA1錯義突變體的基因頻率合計為11.2%；同樣，IFNA2基因有12個SNP位點出現錯義突變，無移碼變異體、終止密碼子和和終止子缺失變異體的SNP位點。IFNA1錯義突變體的基因頻率合計為2.7%(表1)。

表1 IFNA1和IFNA2基因成熟蛋白編碼區非同義突變SNP位點列表(n=2535)

2.2IFNA1基因突變體在不同人群中的分布情況 在千人基因組數據庫收錄的2535個人群中，IFNA1基因的優勢等位基因主要是IFNα1基因，基因頻率為88.915%，IFNA1突變體基因頻率總計為11.085%，其中310例中國人含有308個IFNα1基因，僅有2人帶有雜合的IFNA1基因突變體，1例北京漢族人帶有IFNα1(Ala137Val)突變體，1例南方人帶有IFNα1(Arg148Gln)。IFNA1基因成熟蛋白編碼區的5個非同義突變體的SNP位點，沒有2個或2個以上位點同時出現在同一個基因中，每個突變體只有1個氨基酸殘基與IFNα1蛋白不同。中國人群IFNA1基因突變體的比例明顯低于其它有色人種，與同為黃種人的日本人和越南人無顯著性差異(表2)。另外，45例其它有色人種含有純合的IFNA1基因突變體IFNα1(Ala163Gly)。

表2 不同人群IFNA1基因編碼區非同義突變體SNP位點分布[n(%)]比較

中國人群包括108例中國南方漢族人，103例北京漢族人和99例中國西雙版納傣族人；日本人群包括104例日本東京人(Japanese in Tokyo, Japan， JPT)；越南人群包括101例胡志明市人京族人(Kinh in Ho Chi Minh City,Vietnam，KHV)；非洲/非洲裔人群包括101例肯尼亞威布耶魯亞人(Luhya in Webuye, Kenya ，LWK)、96例肯尼亞巴巴多斯的非洲加勒比豆人(African Carribbeans in Barbados， ACB)、66例美國西南部的非洲裔美國人(Americans of African Ancestry in SW USA， ASW)、99例尼日尼亞埃桑人(Esan in Nigeria，ESN)、113例岡比亞西部的岡比亞人、85例塞拉利昂門德人(Mende in Sierra Leone，MSL)和109例尼日利亞伊巴丹的約魯巴人(Yoruba in Ibadan, Nigeria，YRI)；南亞人群包括86例孟加拉人(Bengali from Bangladesh， BEB)、103例英國的印度泰盧古人(Indian Telugu from the UK，ITU)、96例巴基斯坦拉合爾的旁遮普人(Punjabi from Lahore, Pakistan， PJL)和103例英國的斯里蘭卡泰米爾人(Sri Lankan Tamil from the UK，STU)；美洲人群包括94例麥德林的哥倫比亞人(Colombians from Medellin,Colombia， CLM)、106例德克薩斯州休斯頓的古吉拉特邦印第安人(Gujarati Indian from Houston,Texas， GIH)、67例美國洛杉磯墨西哥血統人(Mexican Ancestry from Los Angeles USA， MXL)、86例秘魯的利馬人(Peruvians from Lima, Peru ，PEL)和105例波多黎各人(Puerto Ricans from Puerto Rico，PUR)

2.3 不同人群IFNA2基因突變體分布情況 在千人基因組數據庫收錄的2535個人群中，IFNA2基因的優勢等位基因主要是IFNα2b基因，基因頻率為97.298%，IFNA2突變體基因頻率總計為2.702%， 所有人群均含有IFNα2b基因，沒有IFNA2突變基因純合個體。其中，310例中國人含有300個IFNα2b基因，中國人群IFNα2b基因頻率為98.39%， 僅有1例中國人帶有雜合的IFNα2b(Leu140Val)基因，9例中國人帶有IFNα2b(Ala120Thr)突變體。IFNA2基因成熟蛋白編碼區的12個非同義突變體的SNP位點沒有2個或2個以上位點同時出現在同一個基因中，每個突變體只有1個氨基酸殘基與IFNα2b蛋白不同。中國人群IFNα2b基因頻率顯著低于非洲人或非洲裔黑人，而與其他人群無顯著性差異(表3)。

表3 不同人群IFNA2基因編碼區非同義突變體SNP位點分布[n(%)]比較

3 討論

α-干擾素系一種多樣化的細胞因子家族。盡管人體內有很多種干擾素，但是批準上市的α干擾素只有IFNα1和IFNα2兩種，包括IFNα1b、IFNα2a和IFNα2b三種α干擾素亞型[15-18]。千人基因組數據庫顯示310例中國人群均有IFNA1和IFNA2基因座，IFNα1基因是IFNA1基因座的優勢等位基因，IFNα2b基因是IFNA2基因座的優勢等位基因，兩者的基因頻率在中國人群中分別為99.6%和98.4%，結果與其它研究基本一致。我們曾測定了100例中國健康漢族人基因組干擾素α1和干擾素α2等位基因的組成，結果發現IFNA1和IFNA2基因座分別均為IFNα1和IFNα2b基因[19]。1994年英國倫敦醫院醫學系和香港瑪麗醫院合作檢測了16例中國CHB患者的IFNA2等位基因，結果均為IFNα2b基因[20]。

應用IFNα1b后，患者產生抗α-干擾素中和抗體的比率高達33.7%，遠遠高于IFNα2a和IFNα2b。中和抗體的產生可能影響了藥物的抗病毒療效。