Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞及程序性死亡受體1在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床病理意義

鞠曉靜

（天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院病理科，天津 301700）

胃癌（gastric cancer）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，好發(fā)于50 歲以上人群，男性發(fā)病率約為女性的2 倍[1]。Hp 感染、飲食習(xí)慣不規(guī)律是引起胃粘膜上皮惡性病變的主要原因。同時(shí)，一些慢性上消化道疾病隨著疾病的進(jìn)展患者也可能出現(xiàn)胃粘膜上皮惡性病變，引發(fā)胃癌。胃癌的發(fā)病較為隱匿，患者早期通常無(wú)明顯癥狀，隨著疾病的進(jìn)展患者可能出現(xiàn)上腹痛的疼痛、食欲減退、消瘦、嘔血黑便等癥狀，多數(shù)患者在就診時(shí)已處于胃癌的進(jìn)展期。疾病進(jìn)展至晚期患者會(huì)出現(xiàn)鎖骨上淋巴結(jié)腫大、腹水等癥狀，胃癌的惡性程度高，若未及時(shí)診治，患者的預(yù)后較差。有研究顯示[2]，胃癌患者外周血及腫瘤局部組織中Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Foxp3+Tregs）比例明顯升高。Foxp3+Tregs 主要介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸，其值升高會(huì)抑制腫瘤的免疫反應(yīng)加速腫瘤的生長(zhǎng)，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[3]。程序性死亡受體1（PD1）主要通過(guò)與配體相互作用使得活化的T 細(xì)胞凋亡發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控作用[4]。PD1 與Foxp3+Tregs 的功能維持與產(chǎn)生存在相關(guān)性，其在多種腫瘤中高表達(dá)，影響患者預(yù)后。為此，本文主要就PD1 與Foxp3+Tregs 在胃癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行研究，分析PD1 與Foxp3+Tregs 表達(dá)情況與患者臨床病理、預(yù)后的關(guān)系及兩者之間是否存在相關(guān)性，為臨床選擇抗腫瘤免疫治療策略提供些許參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011 年1 月～2016 年12 月天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院收治的121 例胃癌患者，取其胃癌組織及癌旁正常組織作為新鮮標(biāo)本。納入患者均經(jīng)病史、臨床特征、胃鏡檢查及組織病理學(xué)檢查確診為胃癌；胃癌的病理類型均為胃腺癌；均未接受過(guò)任何抗癌治療。121 例胃癌患者男女性別比為81∶40。年齡以60 歲為分界線，其中＜60 歲68 例，≥60 歲53 例；腫瘤大小以5 cm 為分界線，其中＜5 cm 63例，＞5 cm 58 例；根據(jù)胃癌的分化程度將其分為高分化型腺癌、中分化型腺癌及低分化型腺癌，分別為20 例、36 例、65 例。根據(jù)胃癌病變位置的不同將其分為胃底癌、胃體癌及胃竇癌，分別為23 例、29 例、69 例。38 例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，83 例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期49 例，Ⅲ、Ⅳ期72 例。

1.2 試劑 Foxp3 兔抗人多克隆抗體、PD1 兔抗人多克隆抗體均購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，通用二氨基聯(lián)苯胺（DBA）顯色劑試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色方法 常規(guī)手術(shù)切除患者胃癌組織及癌旁正常組織作為新鮮標(biāo)本，用10%的中性福爾馬林進(jìn)行標(biāo)本固定，石蠟包埋后連續(xù)切片，厚度為4 μm，采用免疫組化（SP）方法檢測(cè)Foxp3+Tregs 和PD1 的表達(dá)水平。將石蠟切片放置于68 ℃的烤箱中烤干20 min，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，3%H2O237 ℃孵育10 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3 次，5 min/次（以下方法部分PBS 沖洗時(shí)間及次數(shù)同）；抗原修復(fù)：置于95 ℃、pH=6 的枸櫞酸緩沖液中熱修復(fù)，采用冷水沖洗，自然冷卻20 min 后加速冷卻至室溫，PBS 沖洗，正常羊血清工作液封閉，放置于4 ℃冰箱中滴加一抗孵育過(guò)夜，PBS 沖洗后滴加二抗，PBS 沖洗；滴加鏈霉素卵白素工作液（過(guò)氧化物酶標(biāo)記），PBS 沖洗；清水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，干燥，封片。

1.4 免疫組化結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞膜、胞漿和（或）胞核出現(xiàn)黃色至棕褐色染色為陽(yáng)性顯色，胞核陽(yáng)性提示Foxp3 在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）中表達(dá)，胞膜或胞漿陽(yáng)性提示PD1 在TILs 中表達(dá)。每張切片在高倍顯微鏡下選擇5～8 個(gè)視野進(jìn)行觀察，根據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞占比進(jìn)行判定。染色強(qiáng)度：（-）為無(wú)著色、（+）為淺黃色、（++）為棕黃色、（+++）為棕褐色，分別以0、1、2、3 分計(jì)。陽(yáng)性細(xì)胞占比：（-）、（+）、（++）、（+++）分別代表無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞、陽(yáng)性細(xì)胞≤25%、陽(yáng)性細(xì)胞占26%～50%、陽(yáng)性細(xì)胞＞50%，以0、1、2、3 分計(jì)。兩項(xiàng)的分?jǐn)?shù)相加0 分為陰性（-）、1～2分為弱陽(yáng)性（±），3～4 分為陽(yáng)性（++），5～6 分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。切片結(jié)果由2 名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生判定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)本研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，其中符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Pearson 相關(guān)性分析Foxp3+Tregs 和PD1 的相關(guān)性，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Foxp3+Tregs 和PD1 在胃癌組織及癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率比較 Foxp3+Tregs 和PD1 在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 胃癌組織中Foxp3+Tregs 和PD1 表達(dá)情況與胃癌臨床病理的關(guān)系 不同性別、年齡、腫瘤大小及病變位置胃癌組織中Foxp3+Tregs 和PD1 的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同腫瘤分化程度、TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中Foxp3+Tregs 和PD1 的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 胃癌組織Foxp3+Tregs 和PD1 表達(dá)情況與胃癌臨床病理的關(guān)系（n）

表2 （續(xù)）

2.3 胃癌組織中Foxp3+Tregs 和PD1 的相關(guān)性 胃癌組織中Foxp3+Tregs 與PD1 的表達(dá)呈正相關(guān)，見表3。

表3 胃癌組織中Foxp3+Tregs 和PD1 表達(dá)的相關(guān)性

2.4 Foxp3+Tregs、PD1 陽(yáng)性與陰性患者生存情況比較 Foxp3+Tregs 陽(yáng)性患者的生存率為21.33%（16/75），陰性患者的生存率為73.91%（34/46），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PD1 陽(yáng)性患者的生存率為26.92%（21/78），陰性患者的生存率為62.79%（27/43），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

胃癌是發(fā)生于胃粘膜上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能與多種因素綜合作用導(dǎo)致的胃粘膜上皮惡性病變有關(guān)[5]。臨床診斷胃癌較常采用胃鏡檢查。手術(shù)切除、放化療和靶向治療是治療胃癌的主要方式[6-8]。胃癌的臨床癥狀缺乏特異性，疾病初期患者無(wú)明顯癥狀，偶爾表現(xiàn)為上腹部不適、飯后腹脹等癥狀，易誤診為上消化道潰瘍，延誤最佳的治療時(shí)機(jī)。多數(shù)患者在就診時(shí)已處于疾病的進(jìn)展期，若未及時(shí)治療易引起胃出血、幽門或賁門梗阻、胃穿孔等并發(fā)癥[9]。胃癌進(jìn)展至晚期會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者生命，給患者及家庭帶來(lái)巨大的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，在診治的同時(shí)，及時(shí)評(píng)估患者的預(yù)后情況對(duì)于改善生存率也具有一定的臨床價(jià)值。

Foxp3+Tregs 作為T 細(xì)胞亞群，其具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能，可維持機(jī)體免疫耐受、同時(shí)在抑制免疫反應(yīng)中也起著重要作用，其中的Foxp3 是Tregs 分化、發(fā)育、功能維持的決定性因子[10，11]。研究顯示[12，13]，F(xiàn)oxp3+Tregs 數(shù)量及比例在腫瘤患者外周血及腫瘤局部組織中明顯升高，其升高可導(dǎo)致患者自身免疫效應(yīng)T 細(xì)胞對(duì)腫瘤產(chǎn)生免疫耐受，加速腫瘤的發(fā)生發(fā)展，對(duì)患者預(yù)后造成嚴(yán)重影響。PD1 是CD28 免疫球蛋白超家族中的一種免疫抑制分子，分子量為50～55 Kd，其可被誘導(dǎo)表達(dá)于多種免疫細(xì)胞（如T細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等），主要表達(dá)于T 細(xì)胞，可負(fù)向調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的增殖，抑制T 細(xì)胞的免疫功能。阻斷PDI 信號(hào)通路可逆轉(zhuǎn)T 細(xì)胞功能失調(diào)，增強(qiáng)腫瘤特異性T 細(xì)胞反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤免疫治療作用。

本研究通過(guò)測(cè)定121 例胃癌患者胃癌組織及癌旁正常組織中Foxp3+Tregs 和PD1 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)胃癌組織Foxp3+Tregs 和PD1 陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常組織，可能與胃癌組織抑制T 細(xì)胞對(duì)外源及自體抗原的免疫反應(yīng)有關(guān)。進(jìn)一步分析Foxp3+Tregs和PD1 在胃癌組織中的表達(dá)情況及與臨床病理的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同腫瘤分化程度、TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中Foxp3+Tregs 和PD1 的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），分析其原因可能為患者發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移、TNM 分期及分化程度越高，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度越快，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)缺氧嚴(yán)重，PD1陽(yáng)性表達(dá)升高，抑制T 細(xì)胞的免疫功能，影響患者的預(yù)后。癌癥病情越嚴(yán)重，F(xiàn)oxp3+Tregs 和PD1 的陽(yáng)性表達(dá)率越高。本研究隨訪3 年發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3+Tregs與PD1 陰性表達(dá)患者生存情況優(yōu)于陽(yáng)性表達(dá)患者，表明Foxp3+Tregs 與PD1 異常表達(dá)對(duì)患者的生存及預(yù)后有很大的影響。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)oxp3+Tregs 與PD1 呈正相關(guān)，PD1 可誘導(dǎo)Foxp3，使腫瘤特異性T 細(xì)胞轉(zhuǎn)為Tregs，增強(qiáng)免疫耐受。

綜上所述，F(xiàn)oxp3+Tregs 與PD1 可作為判斷患者病情進(jìn)展及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志，腫瘤分化程度、TNM 分期及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移均會(huì)影響其表達(dá)情況，F(xiàn)oxp3+Tregs 與PD1 陽(yáng)性表達(dá)會(huì)影響患者的生存情況。