費城染色體陰性骨髓增殖性腫瘤體細胞突變的研究現狀

吳 雙，王春森

（1.川北醫學院，四川 南充 637000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院，四川 成都 610072）

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）的概念最早由美國血液學家William 于1951年提出，它通常表現為外周血中終末髓樣細胞系的異常增殖。費城染色體陰性的骨髓增殖性腫瘤主要包括真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV）、原發性血小板增多癥（essential thrombocytosis，ET）和原發性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF）。PV的特點是紅系祖細胞和成熟紅細胞的過度產生，ET以巨核系增生為特征，PMF 是一種比PV 和ET 更具侵襲性的疾病，以骨髓纖維化和巨核系擴增為主要特征[1]。MPN 的其他種類還包括慢性髓系白血病、慢性中性粒細胞白血病、系統性肥大細胞增多癥、非特指型慢性嗜酸性粒細胞白血病和不能分類的MPN。MPN 被認為是罕見疾病，但其發病率正在增加。目前認為，MPN 的發病主要是由多能造血祖細胞的體細胞突變所致。MPN 也有家族性聚集的報道，這些家族中發現的異常包括JAK2、MPL、CBL、TET2、CALR 或RBBP6 基因突變，多為體細胞突變，但偶爾也有生殖系細胞突變[2-4]。本文主要綜述MPN 體細胞基因突變致病可能的機制、突變在不同類型中的頻率及預后相關性的研究現狀，旨在加強臨床對患者突變基因的認識。

1 表型驅動突變

MPN 的表型驅動突變包括JAK2、鈣網蛋白基因（calreticulin gene，CALR）和血小板生成素受體基因（thrombopoietin receptor gene，MPL）的突變。8%～10%的PMF 患者和10%～15%的ET 患者沒有常規的JAK2、CALR 和MPL 突變，即“三陰性”MPN，具有不良的臨床結局[5]。

1.1 JAK2 突變 在MPN 中，JAK2 突變主要分為JAK2V617F 突變及JAK2 外顯子12 突變。兩種類型的JAK2 突變其均與MPN 的發生、發展相關。

1.1.1 JAK2V617F 突變 JAK2 基因14 號外顯子突變造成JH2 假激酶結構域（Janus Homology 2，JH2）617位點上保守的纈氨酸被較大的苯丙氨酸所取代[6]，通過構象的變化導致JH2 正常的自抑制功能喪失，使其在沒有造血生長因子的條件下與受體結合，進而導致JAK-STAT、涉及EPO 受體信號傳導的其他通路以及調節細胞凋亡的磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositide-3 kinase，PI3K）通路不依賴細胞因子而激活，從而導致造血細胞的過度增殖[7]，它們在髓系細胞過度增殖和分化中起著重要作用。①JAK2V617F 突變增加細胞DNA 損傷：JAK2V617F突變在大多數MPN 患者中是一種早期體細胞事件，其突變可能增加細胞DNA 損傷，Zhao R 等[8]研究表明，JAK2V617F 突變與DNA 損傷增加有關，后有研究進一步證實了這個觀點，指出JAK2V617F 突變通過細胞周期S 內檢查點響應的疾病限制性損害促進復制分叉停滯，其表達與DNA 損傷增加有關[9]。同時，研究還提示JAK2V617F 的表達導致被γH2Ax 標記的雙鏈斷裂、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因位點突變和自發同源重組事件的頻率增加[9]。②JAK2V617F 突變介導MPN 的免疫逃逸：致癌JAK2V617F 活性增強了突變細胞中程序性死亡受體配體1（Programmed cell death-ligand 1，PD-L1）啟動子的活性和PD-L1 蛋白的表達，而阻斷JAK2V617F活性降低了髓樣突變細胞中PD-L1 的表達[10]。JAK2V617F 突變主要在單核細胞、巨核細胞和血小板中，通過減少T 細胞激活、代謝活動和細胞周期進程，進而導致PD-L1 介導的免疫逃逸[10]。另外，JAK2V617F 突變在吸煙者中更普遍，并且由于慢性炎癥刺激，吸煙被認為是MPN 發生和其它相關髓樣腫瘤的風險因素[11]。③JAK2V617F 突變預后：JAK2V617F 等位基因負荷在PV 中變化很大，50%以上的JAK2V617F 等位基因負荷被發現是進展為骨髓纖維化的危險因素[5]。JAK2 突變與年齡較大、血紅蛋白水平較高、白細胞增多、血小板計數較低相關聯[12]，此類患者的血栓風險較其他突變患者增高[13，14]。

1.1.2 JAK2 基因12 號外顯子突變 JAK2 基因12 號外顯子突變與JAK2V617F 類似，也會導致生長因子的高敏感性以及紅細胞生成信號轉導通路的持續性激活[15]。與JAK2V617F 突變相比，JAK2 外顯子12突變的患者在更年輕時即表現出更明顯的紅細胞增多癥[16]，這表明其促進了紅細胞增多的表型，這些差異可能反映了通過促紅細胞生成素受體的異常信號強度的差異。

JAK2 突變主要是激活JAK-STAT 信號通路在疾病發生中起作用，目前該突變已納入國際預后評分系統。JAK2V617F 突變較JAK2 基因12 號外顯子突變頻率要高得多，而后者突變患者病例數較少，所以目前JAK2V617F 突變的研究更多，而JAK2 基因12 號外顯子突變目前相關研究較少，未來需要更多對JAK2 基因12 號外顯子突變相關的研究。

1.2 CALR 突變 CALR 基因編碼的鈣網蛋白是一種Ca2+結合蛋白，CALR 蛋白主要位于內質網內，除了參與內質網內的生物事件外，還參與內質網以外的各種生物事件。野生型CALR 在巨核細胞、紅細胞分化和造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）的自我更新中都有發揮作用[17]。

1.2.1 CALR 突變類型 目前已經在MPN 中發現了50 個CALR 突變體，所有的突變體都是+2/-1 堿基對移碼，導致外顯子9 的閱讀框架發生+1 移碼，從而產生所有突變CALR 蛋白共有的新的末端氨基酸序列。最常見的兩種形式為[6]：①L367fs*46，一個52bp 的缺失（CALRDEL）；②K385fs*47，一個5bp 的插入（CALRINS）。類型1 相似突變在PMF 中更常見，類型2 相似突變在ET 中更常見[6]，而其他CALR突變類型較少見。

1.2.2 CALR 突變與MPN 目前CALR 反復突變誘發疾病的具體機制尚未明確，有研究提出CALR 突變誘導腫瘤發生的生物學要求：①MPL 及其N-糖基化位點的表達：突變的CALR 在高爾基體中的積累，其進入分泌途徑并與N-聚糖相互作用的能力是其致癌所必須的，這是通過MPL 的組成性激活來實現的[18]；②突變體CALR 的突變型特異性C 末端，特別是它的正靜電電荷[19]；③突變體CALR 和MPL 之間的相互作用：突變的CALR 主要通過MPL JAKSTAT 信號軸的組成性激活實現致癌轉化，突變CALR 與MPL 相互作用，導致MPL 組成性激活，并激活JAK/STAT 通路的下游信號分子，從而驅動增強的巨核細胞生成和前血小板形成[20]；④突變體CALR 的凝集素依賴性功能：突變的CALR 與MPL的結合是其導致MPN 所必需的，但只結合是不夠的，突變體CALR 的凝集素依賴性功能是與MPL 結合和細胞因子獨立生長所必需的[21]。

Cimen BC 等[22]研究表明，CALR 基因的突變驅動MPN 的轉化，引發T 細胞反應，可以通過免疫檢查點阻斷增強MPN 中共享新抗原誘導的針對突變CALR 的T 細胞免疫，這表明免疫療法可以用于清除MPN 中攜帶CALR 突變的惡性細胞。

1.2.3 CALR 突變的預后 目前已在約70%的ET 或PMF 患者中發現了CALR 突變，而僅有極少數PV患者攜帶這種突變，PV 患者中CALR 突變的意義目前尚不清楚[6]。與JAK2/MPL 突變型MPN 相比，CALR 突變型患者往往較年輕，貧血和白細胞增多的發生率較低，血小板計數較高[12，23]。CALR 突變患者的臨床預后比JAK2/MPL 突變患者較好。與JAK2/MPL 突變患者相比，CALR 突變患者血栓形成、貧血、血小板增多和脾腫大的風險更低，總生存期更長[13，24]。

CALR 突變體種類較多，還有待進一步發現更多的突變體，目前最頻繁的突變是CALRDEL（1 型）和CALRINS（2 型），其突變導致了JAK/STAT 信號通路激活。CALR 突變患者預后較JAK2/MPL 突變患者更良好，且CALR 突變1 型患者預后比2 型患者更加良好，未來可進一步對CALR 突變各個亞型進行更多的研究。

1.3 MPL 基因突變 人血小板生成素受體/骨髓增殖性白血病（MPL）蛋白的單跨膜結構域由MPL 基因第10 號外顯子編碼，其突變可產生組成活性受體，從而失去對血小板生成素的依賴，進而促進疾病的發生發展[25]。

1.3.1 MPL 突變類型 MPL 突變最常見的是位于MPL 跨膜和胞漿結構域交界處的色氨酸W515 上的突變，最突出的突變是MPLW515L 和MPLW515K，但也有其他突變，如W515R，W515A 和W515G[26]。W515 位于MPL 的跨膜區，可以阻止MPL 的自發激活，W515 上的大多數突變導致在沒有血小板生成素的情況下激活MPL，并導致JAK2 和STAT 蛋白信號的結構性激活和細胞因子的自主性生長[16]。另一種罕見的胚系突變，MPLS505N 位于跨膜區，以活躍的二聚體方式穩定受體[6]，最初這種突變被描述為遺傳性血小板增多癥的種系突變。

1.3.2 MPL 突變與MPN MPL 主要在HSC 和巨核細胞系中表達，MPL 基因單獨突變就足以在人和小鼠中產生MPN。在PMF 患者中，MPL 基因的突變也能激活JAK/STAT 信號通路，而MPLW515L/W515K 突變更傾向于影響巨核細胞，JAK2 突變則更傾向于影響紅系細胞[6]。事實上，除W515C 和W515P 外，W515 的所有替換都導致MPL 在沒有血小板生成素的情況下被激活。這些MPL 突變改變了血小板生成素受體二聚體的幾何結構，從而導致預先結合的JAK2 蛋白轉磷酸化，導致結構性激活的JAK2/STAT信號通過血小板生成素受體啟動[27]。

1.3.3 預后 研究發現，MPL 突變、JAK2 突變以及JAK2/MPL 突變的患者間的總生存期或無白血病生存期無統計學差異[28]。McNamara CJ 等[29]的研究發現，按突變狀態分層的JAK2 與MPL 突變患者2 年生存率無差異。

1.4 表型驅動突變預后比較 Rumi E 等[5]的研究發現，CALR 突變患者的中位生存期為17.7 年，JAK2突變患者為9.2 年，MPL 突變患者為9.1 年，三陰性患者為3.2 年，與CALR 突變或JAK2 突變患者相比，三陰性PMF 患者白血病轉化的發生率要高得多。由此可見，“三陰性”MPN 的預后是最差的。目前國內外對驅動基因突變預后的研究結果大多類似，未來可以開展更多對驅動基因亞型的研究，以明確各個亞型的預后，但很多亞型病例數極少，研究也相當困難，未來可以開展大樣本、多中心、長時間的研究進一步深度探討其各個亞型的臨床意義。

2 除表型驅動突變外的特異性突變

MPN 基因突變分為特異性突變和非特異性突變。特異性突變除以上表型驅動突變外，還包括LNK2 號外顯子突變，又稱Src 同源2B3（Src homology2B3，SH2B3）突變[6]。LNK（SH2B3）基因編碼是一種調節JAK2 激活的適配器蛋白[30]，所有LNK 蛋白家族成員都含有三個功能結構域：二聚化結構域和位于氨基末端的富含脯氨酸的基序，緊隨其后的是Pleckstrin 同源結構域（PH）和Src 同源2 結構域（SH2）。大多數已鑒定的LNK 突變是針對所有外顯子的錯義突變，以外顯子2 編碼的PH 結構域為主[30]。LNK 非磷酸化的SH2 結構域和JAK2 磷酸化的JH2 結構域結合，從而抑制JAK2 的激活。LNK 突變已經在克隆試驗和小鼠中被證明能促進JAK2V617F 細胞的生長[31]，該突變存在于0～9%的MPN 患者和11%的MPN 后急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AML）患者中[7]，而攜帶該突變的ET 患者總存活率較低[32]。

3 非特異性突變

3.1 表觀遺傳調控基因 參與表觀遺傳調控的基因包括DNMT3A、TET2、ASXL1、EZH2、IDH1/2 等，其中ASXL1、EZH2、SRSF2、IDH1/2 突變已被證明是不利的預后因素，這些遺傳損傷獨立于傳統的預后評分系統，此類患者存在過早死亡或白血病轉化的風險[5]。DNMT3A 突變在PV 和ET 中很少見，但在原發性和繼發性骨髓纖維化（15%）或AML（20%）患者中更常見[33]。JAK2V617F 驅動的MPN 和DNMT3A 基因缺失之間的致癌有協作性[6]，JAK2V617F 表達和DNMT3A 缺失之間的突變合作推動了從早期PV 到晚期骨髓纖維化的進展。DNMT3A 還失活特定的染色質位點，如增強子元件，這些元件控制細胞類型特異性基因表達程序的建立，并在發育和癌癥中起關鍵作用[33]。DNMT3 蛋白家族參與胞嘧啶（5mC）的甲基化，而TET 蛋白家族通過5-甲基胞嘧啶氧化成5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）的活性去甲基化，這一過程被認為對干細胞基因調控特別重要[34]。所有TET2 突變都是功能喪失的突變，導致催化功能受損，5hmC水平降低，導致DNA 超甲基化[34]。雖然既往有些研究提示TET2 突變增加了白血病轉化風險，但最近的研究并沒有發現兩者間的聯系[32,35]。ASXL1 突變與不良預后和較高的白血病轉化率相關。在小鼠模型中，ASXL1 的缺失導致進行性多系細胞減少和異型增生。在PMF 中，ASXL1 的缺失與更嚴重的貧血和患者存活率較低有關[24]。研究顯示[5]，攜帶野生型CALR 和ASXL1 突變的PMF 患者的中位生存期為2.3 年，而攜帶CALR 突變和野生型ASXL1 的PMF患者的中位生存期為10.4 年。Yang H 等[36]的研究表明，ASXL1 截斷突變通過與溴域和末端外域溴域蛋白4 的相互作用而發揮功能增強效應，這一發現為制定針對髓系惡性腫瘤ASXL1 突變的治療方法提供了參考。

EZH2 功能喪失突變與JAK2V617F 突變相關，促進骨髓纖維化發展和預后不良[5，7]。Yang Y 等[37]研究提示，EZH2 的缺失和JAK2V617F 通過增加JAK2V617F 干細胞的適合度在疾病啟動方面具有很強的協同作用。在細胞水平上，EZH2 的缺失與JAK2V617F 一起抑制紅細胞生成和促進巨核細胞的生成，從而加速骨髓纖維化進展[37]。IDH1/2 突變在急變期MPN 患者中聚集，在慢性期MPN 中少見[7]。在急變期MPN 中，IDH 突變預示著不良的預后及較低的存活率[24]。McKenney AS 等[38]研究發現，JAK2V617F 和突變體IDH1/2 的聯合表達可以誘導MPN 進展，改變干/祖細胞功能，損害小鼠的分化，并導致具有白血病前期特征的MPN 表型加速，此類疾病的特點是紅細胞增多癥和白細胞增多癥，突變的IDH1/2 與JAK2V617F 協同表達會導致原始細胞擴張和造血分化受損，最終引起疾病進展和不良結局，該研究還發現JAK2 和IDH1/2 同時突變的患者無白血病生存期較短。

3.2 RNA 剪接相關基因 RNA 剪接相關基因主要包括SRSF2、SF3B1、U2AF1、ZRSR2，突變通常與貧血和血小板減少癥相關[6]。SRSF2 突變的特征之一是髓樣偏向和向急性白血病轉化的風險增加[39]。Smeets MF 等[39]的研究提示，SRSF2 突變在HSC 內的生理性表達導致了小鼠MPN 的發生，且SRSF2 突變必須在HSC 中表達才能啟動MPN。SF3B1 基因與mRNA 剪接相關，其突變在許多情況下可導致RNA衰退[40]。SF3B1 體細胞突變預后良好[24]，攜帶SF3B1突變的患者染色體異常比例較低，血小板計數也較低[41]。剪接因子U2AF1 有兩個突變熱點區域（S34 和Q157），除極少數共同的靶點外，表達S34 和Q157突變的血液細胞存在不同的表達和剪接模式[42]。S34突變可能影響數百個mRNA 的翻譯[42]，而Q157 突變是否影響mRNA 翻譯目前尚不清楚。攜帶U2AF1突變的PV 和ET 患者與野生型患者相比，無骨髓纖維化生存率較低。大約35%的U2AF1 突變影響S34，65%的影響Q157 或其附近，只有Q157（及其附近） 突變與MPN 的總生存期顯著縮短有關[43]。ZRSR2 位于X 染色體上，突變主要發生在男性患者中，ZRSR2 與U2AF2 剪接因子形成異源二聚體，參與識別次要內含子（U12 型）中的3'剪接位點，類似于主要（U2 型）剪接體中的U2AF1，ZRSR2 突變可導致U12 型內含子的剪接異常，致前體mRNA 剪接異常，從而產生異常的mRNA[44]。

3.3 轉錄因子基因 轉錄因子基因主要包括TP53、CUX1、IKZF1、RUNX1、NFE2，其中 TP53、CUX1、IKZF1 均為抑癌基因。TP53 在慢性期MPN 期間維持基因組穩定性方面發揮了關鍵作用[45]，其突變通過增加HSC 的自我更新和對細胞應激的抵抗力來促進AML 轉化[45]。TP53 突變在慢性期MPN 中不常見，但在MPN 后AML 患者中存在[7]。TP53 突變通常與染色體17p 的畸變和5q 的缺失并存，突變通常發生在疾病的后期，患者預后差，轉化為AML 的風險較高，早期死亡風險更高[46]。CUX1 缺失可加速MPN的白血病轉化[47，48]，CUX1 損傷導致的DNA 修復功能障礙在MPN 的發病機制中起著重要作用，且功能喪失突變比錯義突變會產生更嚴重的功能缺陷[49]。An N 等[50]發現，CUX1 基因敲除的小鼠發生了MDS 伴貧血和三系發育不良，最終導致HSC 衰竭。該研究指出，CUX1 是維持HSC 穩態的關鍵調節因子，可維持HSC 的靜止狀態，并抑制HSC 的增殖，單個7q基因CUX1 的減少足以引起髓系疾病。IKZF1 的缺失與MPN 向AML 的轉化有關，其在慢性期MPN 中很少見，但在急變期MPN 患者中可檢測到，約占17%[26]。IKZF1 突變可能導致JAK-STAT 通路的激活，因此其與MPN 的發生發展相關[51]。RUNX1 失活突變主要通過減少髓系分化和增加HSC 自我更新促進AML 的發展，其突變與較短的總生存率相關[31]。約4%～13%的MPN 后AML 患者存在RUNX1 突變，與野生型相比，此類患者的生存期顯著縮短[31，35]。NFE2突變易導致轉基因小鼠發生白血病轉化[52]。JAK2V617F/NFE2 共同突變小鼠的血紅蛋白和白細胞計數比JAK2V617F 突變小鼠高，表明突變體NFE2 促進了骨髓生成，并增強了JAK2V617F 誘導的MPN 表型[52]。

3.4 細胞信號轉導相關基因 此類基因主要包括NRAS、KRAS、NF1、CBL、PTPN11、PPM1D。RAS 信號通路突變（NRAS/KRAS 突變）在MPN 中與白血病轉化有關，而NRAS 突變更頻繁，MPN 后AML 患者中存在7%～15%的NRAS/KRAS 突變[53]。You X 等[54]研究表明，KRAS 突變通過鳥嘌呤核苷酸交換因子Sos1 的介導驅動侵襲性MPN 表型，以Sos1 和致癌KRAS 相互作用為靶點的治療可以提高KRAS 突變MPN 患者的存活率。與JAK-STAT 信號通路的突變相比，RAS 信號通路的突變與較短的總生存期和預后不良相關[43]。NF1 是RAS 信號的負調控因子，NF1的喪失在功能上等同于激活RAS 基因突變[6]。CBL突變在MPN 中很少見，通常與涉及RUNX1、FLT3、JAK2 和TP53 的突變共存[51]，其突變也與MPN 的低生存率顯著相關[43]。PTPN11 屬于原癌基因，其在MPN 中的突變與較短的總生存期相關[43]。PTPN11雜合錯義突變在MPN 后AML 患者中占6%～8%，與患者生存期縮短有關[35]。PPM1D 也是一種原癌基因，其突變在健康人的血液及其它腫瘤患者中也被檢測到，但在接受過化療并被診斷出患有與治療相關的髓系腫瘤的患者中更為常見[46,55]。截短PPM1D突變會產生化療耐藥表型，導致PPM1D 突變的造血細胞在體內外化療時選擇性擴增。在化療的情況下，PPM1D 突變細胞的DNA 損傷反應被取消，導致細胞周期進程改變，凋亡減少，線粒體啟動減少[55]。

4 突變數量及順序與預后相關

不僅不同的突變與預后相關，有害突變的數量本身也代表了一個額外的不利預后因素。研究發現，2 個或更多的突變與縮短的無白血病生存期相關，且突變數量越多預后越差[32]。同時，突變的順序也會影響臨床表型。如Ortmann CA 等[56]研究顯示，在同時含有TET2 或DNMT3A 突變的JAK2 突變MPN中，首先獲得JAK2 突變的患者更有可能出現PV，并增加血栓形成的風險；相反，TET2 優先或DNMT3A 優先的患者更有可能患有ET。另外，獲得體細胞突變的順序還會影響治療反應、干細胞和祖細胞的生物學以及MPN 患者的克隆進化等[15]。

5 總結

JAK2、CALR、MPL 突變激活JAK-STAT 信號是MPN 發病的核心，雖然目前暫未明確JAK2、MPL、CALR 和其他突變在MPN 發病中的具體意義，以及在決定疾病表型和干細胞受累程度中的相對作用。但目前認為，無論MPN 患者診斷或JAK2 突變狀態如何，其特征都為獨特的基因表達標簽，即JAKSTAT 靶基因表達增加，表明這一通路在MPN 的發病機制中具有重要的作用。驅動基因突變伴隨其它體細胞突變很常見，通常與疾病進展有關。MPN 的非特異性突變涉及廣泛的細胞通路，而由于大多數突變造成相關功能喪失，故大多數非特異性突變基因是髓系腫瘤的抑制基因。目前MPN 的大多數非特異性突變基因的預后信息不足，且對多個突變如何協同導致預后不良及其有害突變如何具體影響蛋白質的功能，以及是否還有新的不良預后突變等都有待進一步發現。