丙泊酚對人神經膠質母細胞瘤（U343）活性、凋亡、侵襲和轉移能力的影響

王昆鋒，陳 功，丁 潔

（深圳大學第五附屬醫院/深圳寶安中心醫院麻醉科，廣東 深圳 518000）

原發顱內腫瘤的發病率為7.8/10 萬人～12.5/10萬人，可發生于任何年齡，以20～50 歲多見，神經膠質母細胞瘤是成人最常見原發性中樞神經系統惡性腫瘤，其來源于神經上皮，約占全部顱內腫瘤的40%～50%。臨床上主要采用手術方式治療神經膠質母細胞瘤，但是腫瘤呈浸潤性生長，具有較強的轉移和侵襲能力，與正常腦組織間邊界難于區分，難以作到完全切除干凈，一般以術后配合化學治療、放射治療等綜合治療，患者預后較差，目前患者的存活期中位數只有1～1.5 年，嚴重威脅人類的健康[1]。因此，尋找新的藥物和方法抑制神經膠質母細胞瘤的增殖和侵襲轉移一直是國內外研究的熱點和難點。丙泊酚是臨床常用的靜脈麻醉藥，具有作用時間短，作用平穩等特點。研究表明[2,3]，丙泊酚有較好的抑制多種腫瘤細胞（胃癌、肝癌和胰腺癌等）生長和轉移。另有研究表明[4，5]，丙泊酚對人神經膠質細胞瘤侵襲和遷移能力具有明顯的抑制作用。基于此，本研究主要探究不同濃度的丙泊酚對人神經膠質母細胞瘤（U343）活性、凋亡、侵襲和轉移能力的影響及其可能的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 超凈工作臺（Thermo），常規氧氣及二氧化碳培養箱（Thermo），CCK-8 細胞活性分析儀，低溫高速離心機（Eppendorf），流式細胞分析儀（Beckman Coulter）,Western blot 顯影儀器（紫外白光切膠）。丙泊酚注射液（得普利麻），DMEM/F12 培養基和胎牛血清（Gibco）。一抗：兔抗GAPD 多克隆IgG 抗體（杭州賢至生物科技有限公司）二抗：HRP偶聯山羊抗兔IgG 二抗。

1.2 人神經膠質母細胞瘤（U343）的培養 將新配制的含10%胎牛血清的Gibco 培養液加入到人神經膠質母細胞瘤中（購于中國科學院細胞庫）。細胞常規置于37 ℃、5% CO2常氧培養箱中培養。細胞貼壁達80%以上進行傳代，將傳代后處于對數生長期的人神經膠質母細胞瘤（U343）用于實驗。

1.3 細胞模型的建立 隨機將處于對數生長期的細胞分為4 組，分別為N 組，S2 組（Propofol 2 μmol/L），S5組（Propofol 5 μmol/L），S10 組（Propofol 10 μmol/L）。四組實驗細胞均加入含10%胎牛血清的Gibco 培養液，除N 組外，其余3 組加入相應劑量的丙泊酚。

1.4 CCK-8 法檢測細胞活力 將人神經膠質母細胞瘤（U343）按1×105個細胞/100 μl 的密度將其接種于96 孔板中。細胞接種完成后，放置在37℃、5%CO2常氧培養箱中培養。待細胞貼壁生長后，從培養箱中棄去舊的培養基，PBS 清洗2 次后建模，再次分為4 組，分別為N 組，S2 組（Propofol 2 μmol/L），S5組（Propofol 5 μmol/L），S10 組（Propofol 10 μmol/L），每組分6 個復孔。放入常規培養箱中培養48 h 后，向每孔加入CCK-8 溶液（10 μl），將培養板在常規培養箱內孵育2 h，用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 將建模完成后細胞取出，消化（0.25%的胰酶）、離心（室溫2000 rpm 5 min），將收集的細胞重新懸浮一次（1×PBS 4℃）。再次離心（2000 rpm 5 min）后加入300 μl 的1×Binding Buffer洗滌細胞使沉淀細胞懸浮。加入5 μl 的Annexin VFITC，混勻，避光，室溫孵育15 min。上機前5 min 再進行PI 標記，加入5 μl PI。最后上機前加入200 μl的1×Binding Buffer。

1.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 實驗前1 天用黑筆于6 孔板背面畫2 條黑色平行直線，消毒滅菌后備用。第2 天將實驗細胞接種于6 孔板上。待細胞貼壁后，用100 μl 槍頭在每個培養格里劃3 條垂直于孔板背面黑線的劃痕。然后將有劃痕的培養格隨機分為4 組，分別為N 組，S2 組（Propofol 2 μmol/L），S5組（Propofol 5 μmol/L），S10 組（Propofol 10 μmol/L）。繼續常規培養48 h 后用倒置顯微鏡觀察被黑色線所標記的劃痕內不同組別腫瘤細胞遷移情況，計算細胞劃痕閉合率。具體計算公式=（0 h 劃痕寬度-48 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度。

1.7 Western blot 檢測蛋白表達 裂解細胞后提取各組總蛋白，上樣到凝膠上（SDS-PAGE），電泳分離蛋白。然后將電泳分離的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上（PVDF），轉模完成后將膜置于5% w/v 脫脂奶粉的1×TBST 封閉緩沖液中1 h，加入一抗孵育過夜（4℃）。第2 天將膜取出，用TBST 清洗3 次以洗去未結合一抗，加入二抗室溫孵育1 h，采用western blot 顯影儀器曝光顯影。采用Image J 軟件對蛋白質條帶進行灰度值的定量分析。

1.8 統計學方法 數據采用SPSS 13.0 統計軟件進行分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞活力（OD 值）比較 CCK-8 檢測顯示，S2 組、S5 組及S10 組OD 值低于N 組，差異有統計學意義（P＜0.05），且隨著丙泊酚濃度的升高細胞活力降低，OD 值降低，見圖1。

2.2 各組細胞凋亡情況 流式檢測顯示，S2 組、S5 組及S10 組細胞凋亡率和死亡率高于N 組，差異有統計學意義（P＜0.05），且隨著培養皿中丙泊酚濃度的升高，細胞凋亡（早期凋亡+晚期凋亡）率和死亡率升高，見圖2、表1。

圖1 各組細胞活力（OD 值）比較

圖2 各組細胞凋亡情況

表1 各組細胞凋亡和死亡情況（%）

2.3 各組細胞遷移情況 劃痕實驗顯示：S2 組、S5 組及S10 組遷移率低于N 組，差異有統計學意義（P＜0.05），且隨著培養皿丙泊酚濃度升高，遷移能力降低，見圖3。

圖3 各組遷移率比較

2.4 各組Caspase-3、VEGF 蛋白表達 蛋白免疫印跡法顯示，S2 組、S5 組及S10 組凋亡相關蛋白Caspase-3 表達高于N 組，VEGF 蛋白表達低于N 組，差異有統計學意義（P＜0.05），且隨著皿丙泊酚濃度升高，Caspase-3 表達量升高，VEGF 表達量降低，見圖4～圖7。

圖4 各組Caspase-3 蛋白曝光顯影比較

圖5 各組Caspase-3 蛋白灰度相對比值比較

圖6 各組VEGF 蛋白曝光顯影比較

圖7 各組VEGF 蛋白灰度相對比值比較

3 討論

神經膠質母細胞瘤是成年人大腦腫瘤中最常見的腫瘤，惡性程度高，侵襲能力強，往往治療效果差。近些年尋找抑制神經膠質母細胞瘤的生長、侵襲的治療方法一直是研究的熱點和難點。丙泊酚是臨床常用的麻醉藥物，具有明顯的神經保護作用，近年來對于其抗癌作用是研究的熱點。誘導腫瘤細胞凋亡是治療癌癥的創新思路，細胞凋亡是細胞自主程序性死亡，在腫瘤發生發展過程中起著重要作用，其中涉及多種基因的激活、表達以及調控[6]。Caspase-3是Caspase 凋亡蛋白家族中公認的最為重要的蛋白酶，是細胞凋亡三條通路中兩條通路的交匯點，在激發細胞內源性與外源性凋亡通路中發揮著重要的作用[7]。此外，Caspase-3 的激活可誘導DNA 的降解引發細胞凋亡，當Caspase-3 活性受到抑制，細胞的增殖與凋亡就會發生紊亂，可直接或間接地促進多種腫瘤的生長[8]。研究顯示[9]，Caspase-3 蛋白表達水平的高低與神經膠質瘤惡性程度及患者預后呈負相關。

Folkman J[10]于1971 年提出的“腫瘤新生血管理論”，當腫瘤直徑大于2.0 mm 時，必須有新生血管為腫瘤細胞的快速繁殖提供所需的營養成分，為腫瘤細胞轉移提供途徑。因此，新生血管的生成是惡性腫瘤生長、浸潤與轉移的關鍵，如何抑制腫瘤新生血管生成是當前的研究熱點與難點。Gee MS 等[11]研究發現，抑制腫瘤新生血管形成時，腫瘤組織內部發生缺血缺氧性改變，從而誘導大多數腫瘤細胞發生了凋亡。細胞因子（VEGF）是一種具有高度特異性的生長因子，增加血管通透性，增加血漿蛋白和蛋白纖維原的滲出，促進血管內皮細胞生長，有利于腫瘤的血管生長，可提高腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。VEGF表達量的多少與腫瘤大小、浸潤程度和轉移侵襲能力直接有關[12]。抑制VEGF 因子的表達，人膠質母細胞瘤的新生血管生成受到明顯抑制，腫瘤血管形成減少使腫瘤細胞發生缺血、缺氧改變，促使腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移[13]。本研究結果顯示，CCK-8 檢測顯示，S2 組、S5 組及S10 組OD值低于N 組，差異有統計學意義（P＜0.05），且隨著丙泊酚濃度的升高細胞活力降低，OD 值降低。流式檢測顯示，S2 組、S5 組及S10 組細胞凋亡率和死亡率高于N 組，差異有統計學意義（P＜0.05），且隨著培養皿中丙泊酚濃度的升高，細胞凋亡（早期凋亡+晚期凋亡）率和死亡率升高；劃痕實驗顯示：S2 組、S5 組及S10 組遷移率低于N 組，差異有統計學意義（P＜0.05），且隨著培養皿丙泊酚濃度升高，遷移能力降低；蛋白免疫印跡法顯示，S2 組、S5 組及S10 組凋亡相關蛋白Caspase-3 表達高于N 組，VEGF 蛋白表達低于N 組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示丙泊酚可以明顯抑制人神經膠質母細胞瘤的細胞活性和轉移遷移能力，增加腫瘤細胞凋亡（早期凋亡+晚期凋亡）率和死亡率，考慮原因為丙泊酚通過激活Caspase-3 蛋白的表達，激發細胞內源性與外源性凋亡通路，降低腫瘤細胞活性，誘導腫瘤細胞發生凋亡和死亡，同時其還可明顯抑制VEGF 的表達，以達到抑制腫瘤內血管再生，而腫瘤血管形成減少使腫瘤細胞發生缺血、缺氧改變，從而抑制腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移，甚至誘導腫瘤細胞凋亡。但丙泊酚對凋亡相關蛋白Caspase-3 和細胞因子VEGF 差異表達的具體調控機制尚未完全明了，還有待進一步研究。

綜上所述，丙泊酚能降低人神經膠質母細胞瘤（U343）的活力，增加細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，且抑制程度10 μmol/L＞5 μmol/L＞2 μmol。