軟骨寡聚基質蛋白在顳下頜關節滑膜軟骨瘤病中的表達

韓瑋華，羅海燕，郭傳瑸，寧 琦，孟娟紅△

(北京大學口腔醫學院·口腔醫院，1.頜面外科，2.病理科 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 口腔數字化醫療技術和材料國家工程實驗室 口腔數字醫學北京市重點實驗室，北京 100081)

滑膜軟骨瘤病又稱原發性滑膜軟骨瘤病、滑膜軟骨化生，是一種良性腫瘤，但術后容易復發[1]，好發于膝、髖、肘等大關節[2]，顳下頜關節相對少見。顳下頜關節滑膜軟骨瘤病(synovial chondromatosis of the temporomandibular joint，TMJSC)在女性較男性多見，可引起顳下頜關節腫痛、開口受限等癥狀，其發生可能與炎癥、創傷等因素有關[3-4]，但關于TMJSC發病機制的基礎研究較缺乏，相對集中于可能影響滑膜軟骨化生及軟骨增殖的因素等[5]。

目前認為TMJSC的發生可能與創傷、炎癥等刺激因素有關；刺激作用下表達增高的細胞因子可能參與該疾病的發生與發展，如轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員TGF-β1、TGF-β3[6-10]和骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein，BMP-2)[11-12]等。創傷、炎癥等刺激因素作用同樣可導致軟骨寡聚基質蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)表達增高。體外實驗證明，過度表達COMP可促進骨髓間充質干細胞的軟骨分化和軟骨外基質的形成分泌[13]，并維持軟骨細胞表型[14]；在誘導間充質干細胞軟骨分化過程中，COMP可促進TGF-β3、TGF-β1、BMP-2等細胞因子的成軟骨誘導作用[15-18]，但尚無研究涉及COMP在滑膜細胞軟骨化生過程中是否存在上述促進作用。

因此，本研究通過在蛋白質及mRNA水平檢測TMJSC滑膜組織中COMP的表達情況，分析COMP與TGF-β3、TGF-β1、BMP-2之間的關系，并與正常滑膜組織進行比較，初步探討COMP在TMJSC發病中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 樣本來源

選取2011年1月至2020年2月于北京大學口腔醫院就診并接受手術治療，且術后病理學檢查診斷為TMJSC的患者48例，其中有4例患者復發后進行二次手術(共計52例)；同時選取3例因髁突骨折行開放性手術復位固定患者的正常滑膜組織作為對照組。將含有滑膜組織及游離體的部分TMJSC病變組織經甲醛溶液固定及脫鈣包埋處理制成蠟塊；新鮮標本中12例病變標本經RNA Later保存用以提取RNA操作；3例標本經組織破碎后提取目標蛋白，與正常滑膜組織對照進行蛋白免疫印跡試驗。對照組滑膜組織處理同新鮮病變標本的處理。

本研究獲得北京大學口腔醫院倫理委員會審核(批件號：PKUSSIRB-201947090)， 且研究方法遵循北京大學口腔醫院倫理要求。

1.2 主要試劑及儀器

大鼠源性抗人COMP抗體(ab11056)、兔源性抗人TGF-β3抗體(ab15537)、兔源性抗人TGF-β1抗體(ab215715)購自Abcam，小鼠源性抗人BMP-2抗體(66383-1-lg)購自Proteintech，大鼠二抗(PV-9004)、DAB顯色試劑盒(ZLI-9019)、封閉用正常羊血清(ZLI-9022)、EDTA抗原修復液(ZLI-9066)購自北京中杉金橋生物技術有限公司，兔/小鼠二抗及DAB顯色試劑盒(GK600710)購自基因科技上海股份有限公司，RNA Later(AM7021)購自Thermo-Fisher。實驗儀器包括實時熒光定量PCR儀(7500，APPLIED BIOSY)等。

1.3 蘇木精-伊紅染色法和免疫組織化學實驗

1.3.1蘇木精-伊紅染色法 選取上述TMJSC患者保存完好的石蠟組織52例，進行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色：切片厚度4 μm，經脫臘、各級乙醇至水洗，蘇木素染色、分化，伊紅染色、脫水、透明、封片。

1.3.2免疫組織化學實驗 選取TMJSC石蠟組織樣本52例，經切片、脫蠟、抗原修復、過氧化物酶處理、血清封閉、一抗孵育過夜、二抗孵育、DAB顯色、復染、脫水等步驟，觀察COMP、TGF-β3、TGF-β1、BMP-2在TMJSC滑膜組織及游離體中的表達情況。設立正常滑膜組織對照組(3例)和陰性試劑對照組(磷酸鹽緩沖液代替一抗孵育3例)。光鏡下觀察不同組織中蛋白的染色情況及陽性分布。COMP、TGF-β3、TGF-β1及BMP-2等蛋白的陽性表達部位均位于細胞漿內(棕黃色染色提示表達陽性)。免疫組織化學實驗計數方法參照文獻[19]。兩名研究人員分別在每個切片中隨機選取5個不同高倍鏡視野(除邊緣視野選取上、下、左、右、中5個視野)，計數細胞總數與蛋白質陽性表達細胞數，重復計數3次，取平均值作為細胞數，計算蛋白質陽性表達率。蛋白質表達的判定根據顯色強度與陽性表達率綜合計分，顯色強度計分為：無顯色1分，黃色2分，棕褐色3分；陽性表達率計分為：≤10%為1分，11%～50%為2分，≥50%為3分；顯色強度分值×陽性表達率分值所得數值為蛋白質的表達評分，其中1分為陰性(-)，≥2且<4分為弱陽性(+)，≥4且<6分為陽性(++)， ≥6分為強陽性(+++)。

1.4 實時熒光定量PCR檢測

采用實時熒光定量PCR檢測并比較TMJSC與正常滑膜組織中COMP、TGF-β3、TGF-β1及BMP-2mRNA表達情況，引物序列見表1，引物購于生工生物工程(上海)股份有限公司。選取RNA Later中保存完好的TMJSC組織12例，正常滑膜組織3例，樣本經組織破碎、分層、沉淀、4 ℃ 12 000 r/min離心、清洗、溶解等步驟提取組織mRNA，并檢測其濃度；經銀質梯度PCR儀逆轉錄為cDNA；采用實時熒光定量PCR儀定量分析擴增產物，PCR條件為：預變性95 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s；目的基因均退火60 ℃，30 s(內參GAPDH退火55 ℃，30 s)；延伸72 ℃，1 min；變性、退火、延伸共40個循環, 72 ℃， 6 min。

表1 mRNA 引物序列

1.5 蛋白免疫印跡試驗

選取TMJSC組織3例，正常滑膜組織1例，采用蛋白免疫印跡法檢測兩種組織中COMP、TGF-β3、TGF-β1及BMP-2蛋白定量表達情況，管家基因GADPH作為對照。用RIPA裂解液(200 μL RIPA+4 μL PMSF)裂解組織提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取適量蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將電泳后的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(polyviny-lidene difluoride，PVDF)膜，脫脂牛奶封閉30 min，分別用大鼠源性抗人COMP抗體(1 ∶1 000)、兔源性抗人TGF-β3抗體(1 ∶1 000)、兔源性抗人TGF-β1抗體(1 ∶1 000)、小鼠源性抗人BMP-2抗體(1 ∶1 000)封閉過夜。等滲鹽溶液加Tris-HCl緩沖液(TBST)洗滌3次后分別用對應二抗室溫孵育30 min，最后X線曝光、顯影和定影后觀察。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 TMJSC組織病理學表現

TMJSC病變組織中受累滑膜呈不同程度充血、肥厚，可見散在的或成團塊的軟骨結節。光鏡下可見滑膜組織層數不一，滑膜表層細胞及纖維組織增生，主要由成纖維細胞樣滑膜細胞構成，排列方向不完全一致，滑膜下層可見少量血管增生；軟骨結節由成熟的透明軟骨構成，軟骨細胞聚集成簇，中間有含血管及成纖維細胞的結締組織分隔(圖1)，遠離滑膜組織的軟骨細胞體積較大，胞核不明顯。

Synovial chondromatosis consists thickened synovial tissue (black arrow) and clustered chondrocytes (white arrow).

2.2 免疫組織化學結果及蛋白陽性表達分析

免疫組織化學結果顯示，正常滑膜組中未見明顯COMP、TGF-β3、TGF-β1、BMP-2陽性表達(圖2A～D)。TMJSC中COMP、TGF-β3、TGF-β1及BMP-2蛋白半定量表達評分情況見表2。TMJSC的滑膜組織及鄰近滑膜的軟骨細胞內COMP表達較多，與正常滑膜組有明顯差異；TGF-β3、TGF-β1及BMP-2表達分布與COMP類似，多見于滑膜組織內，軟骨細胞中表達水平稍低，但較對照組仍有明顯差異(圖2E～H),其中TGF-β3半定量蛋白表達水平明顯高于TGF-β1和BMP-2(P<0.05)。TMJSC復發病例與未復發病例相比，COMP陽性表達差異有統計學意義(P<0.05，表3)。

Abbreviations as in Table 1. A-D, no positive expression of target protein was found in normal synovium of temporomandibular joint (IHC ×100). E-H, the positive expression of target proteins in synovial membrane and adjacent chondrocytes was higher (black arrow, IHC ×400).

表2 TMJSC中相關蛋白的免疫組織化學表達

表3 TMJSC復發和未復發病例間免疫組織化學COMP半定量蛋白表達差異

2.3 實時熒光定量PCR結果及mRNA表達水平分析

TMJSC滑膜組織中COMP、TGF-β1、TGF-β3及BMP-2mRNA表達情況如圖3A所示，與正常滑膜組織相比分別升高1.72倍、1.45倍、1.43倍和0.69倍。

2.4 蛋白免疫印跡結果

根據免疫印跡條帶(圖3B)，與正常滑膜組織相比，3例TMJSC滑膜組織的COMP、TGF-β1、TGF-β3及BMP-2表達均有升高。

3 討論

滑膜軟骨瘤病是發生在關節、滑膜囊或腱鞘滑膜內的良性、結節性軟骨增生性疾病[20]。TMJSC發病機制尚不清楚，多數學者認為可能與損傷及炎癥因素有關，某些促進滑膜細胞軟骨分化及增殖的因子可能參與促進該疾病的發生與發展。Fujita等[21]通過免疫組織化學實驗發現在TMJSC患者的滑膜上存在TGF-β和肌腱蛋白。Pearson等[9]認為TGF-β3在刺激細胞外基質蛋白，特別是肌腱蛋白的生成方面具有重要作用，而肌腱蛋白在軟骨形成中起重要作用[10]。Li等[6]研究發現，TMJSC患者的滑膜組織和游離體中均有TGF-β3表達，并可促進軟骨形成基因(Sox9、Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等)表達，滑膜組織中還可見TGF-β1的陽性表達，在TMJSC發生和發展過程中有誘導滑膜細胞成軟骨分化作用，且在調節細胞增殖和分化方面也具有重要作用。體外實驗證明，TGF-β1可誘導滑膜組織發生軟骨化生[8]。Nakanishi等[11]報道了TMJSC患者的滑膜和游離體高度表達BMP-2和BMP-4，且BMP-2還可刺激蛋白聚糖的表達，進而增加TMJSC的軟骨化生；體外實驗證明，BMP-2可誘導肌肉和滑膜細胞軟骨分化[12]。

Abbreviations as in Table 1. A, mRNA expressions in normal synovium and TMJSC tissue (* P<0.05); B, the expressions of target proteins in normal synovium and TMJSC tissue (1-3, three different TMJSC patients’ synovium).

COMP是一種五聚體糖蛋白[22]，廣泛表達于軟骨、滑膜、肌腱等組織中[23]，過度運動、外傷、炎癥等多種因素可致其表達水平增高[24-25]。COMP是細胞外基質蛋白的一種，是軟骨中主要的非膠原蛋白，可促進軟骨細胞分化，并可作用于軟骨細胞，維持軟骨細胞于增殖狀態，影響軟骨基質的形成[26]。除軟骨細胞外，滑膜、肌腱等多種非軟骨組織也可表達COMP，其表達水平在受到過度運動、關節炎癥等多種生理和病理因素影響后可能增高。研究表明，在誘導間充質干細胞軟骨分化的過程中，COMP與其他增殖分化相關因子間存在相互作用。在TGF-β3誘導前軟骨干細胞分化過程中，COMP的表達先于Ⅱ型膠原[14-15]。Li等[16]利用顆粒培養法誘導原代人骨髓干細胞向軟骨細胞分化，發現COMPmRNA的表達比Ⅱ型膠原早，且COMP的表達需要TGF-β1的參與。Haudenschild等[17]研究表明，COMP呈重復模塊化結構，具有作為生長因子支架的能力，成熟的COMP蛋白可與多個TGF-β1分子結合，引起TGF-β1依賴的轉錄活動增強。在BMP-2誘導骨髓間充質干細胞分化的過程中，過表達COMP可使成軟骨相關指標(Ⅱ型膠原、Sox9、蛋白聚糖)的基因表達水平顯著增強，而成骨分化受到抑制[18]。但目前尚未見研究涉及到顳下頜關節滑膜細胞軟骨分化過程中是否存在COMP對TGF-β3、TGF-β1及BMP-2誘導成軟骨分化的促進作用。

本研究發現，在TMJSC病變組織中，COMP表達明顯增高，且陽性表達多見于滑膜細胞及鄰近滑膜組織的軟骨細胞，同時TMJSC病變組織中COMP mRNA表達水平增高，提示COMP可能與TMJSC發病有關。TMJSC復發組COMP表達水平也明顯高于未復發組，表明COMP表達水平增高可能提示滑膜細胞軟骨化生及軟骨增殖能力較強。本研究驗證了TMJSC中TGF-β3、TGF-β1、BMP-2表達均有增高，該結論與以往文獻結論一致，另外，我們還發現與COMP類似，上述細胞因子陽性表達多見于滑膜組織及鄰近的軟骨細胞，提示其誘導滑膜細胞軟骨化生的作用可能與COMP相關。

基于顳下頜關節滑膜干細胞具有多向分化潛能[27-28]，在某些特定的誘導作用下可化生為軟骨細胞[29]，結合在間充質干細胞成軟骨分化過程中COMP和增殖分化相關因子間存在相互作用，我們推測：在關節炎癥、創傷的刺激下，滑膜組織中COMP表達水平增高，且可能與其他細胞因子(如TGF-β3、TGF-β1、BMP-2)協同作用，誘導軟骨形成。關于COMP能否誘導滑膜干細胞向軟骨細胞分化并維持軟骨細胞的增殖狀態，從而在TMJSC的發生和發展中發揮一定作用，還需進一步的研究來驗證。

本研究檢測了TMJSC滑膜COMP的表達，并對其可能作用機制進行了初步探討，結果表明，TMJSC病變中COMP的表達較正常滑膜組織增高，且與TGF-β3、TGF-β1、BMP-2等增殖分化因子間存在協同作用，在TMJSC的發病中可能發揮一定作用，其具體作用機制仍需進一步的實驗研究。