廣泛型侵襲性牙周炎患者牙根形態異常與相關致病基因的關聯

劉 建，王憲娥，呂 達，喬 敏，張 立，孟煥新，徐 莉，毛銘馨

(北京大學口腔醫學院·口腔醫院，牙周科 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 口腔數字化醫療技術和材料國家工程實驗室 口腔數字醫學北京市重點實驗室，北京 100081)

廣泛型侵襲性牙周炎(generalized aggressive periodontitis, GAgP)因發病年齡早、疾病進展快、具有家族聚集性、早期出現牙齒松動和失牙等備受關注。GAgP 是多因素的復雜性疾病, 盡管菌斑生物膜是GAgP的始動因素，但與遺傳有關的宿主易感性(如基因多態性)和局部解剖因素(如根形態異常)是影響疾病進展速度和嚴重程度的重要因素。

GAgP被普遍認為與易感基因多態性有關，許多學者已發現多個基因的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)與GAgP的易感性增加有關[1]，如維生素D受體(vitamin D receptor，VDR) 基因多態性與GAgP的關系已得到驗證[2-3]。

以往系列研究已證實我國GAgP患者特有的牙根形態異常(錐根、細長根、冠根比例失常、彎曲根、融合根)的發生率明顯高于慢性牙周炎患者和牙周健康者[4-6]；根形態異常核心家系研究顯示有遺傳傾向，遺傳度為30%～50%[7]；根形態異常牙的牙槽骨吸收程度明顯大于非根形態異常牙，根形態異常牙數與重度骨吸收牙數成正相關，分析原因是這些牙承受牙合力的能力降低，導致疾病進展加快[8]。

牙根的發育是口腔上皮組織和間充質相互作用的結果，其發育異常可能與某些基因缺失或變異有關，機體內外的不利因素作用于牙齒硬組織形成期、牙根發生期等階段時，會形成相應的臨床表現[9-11]。以往研究表明很多基因都與牙根的發育有關，包括同源異形盒基因1、同源異形盒基因2、骨形成蛋白基因、基質金屬蛋白酶9、轉化生長因子β、核心結合因子α1、VDR等[12-16]。基礎研究還表明降鈣素受體(calcitotin receptor，CTR)影響成牙本質細胞分化，不排除與牙根發育有關[17-18],但既往多是關于基因是否會阻止牙根形成或導致牙根缺失的研究[16，19-22]，都是基于細胞或動物實驗[23-24]，尚未見GAgP患者牙根形態異常與致病基因的關聯研究。

本研究旨在初步分析GAgP患者中牙根形態異常與骨代謝和牙根發育相關基因的關系，探索可能與GAgP患者發生牙根形態異常相關的基因多態性位點，為GAgP患者實施針對性的預防和個性化治療提供理論依據[25]。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2001年1月至2012年12月就診于北京大學口腔醫院牙周科門診的179例GAgP患者作為研究對象。GAgP患者納入標準參照1999年牙周病分類法國際研討會制定的診斷標準(1999年新分類法)：(1)患者年齡小于36歲；(2)快速的牙槽骨破壞和附著喪失，全口至少有6顆牙(至少有3顆為非第一磨牙和切牙)的探診深度(probing depth，PD)≥5 mm，鄰面附著喪失≥3 mm，均經全口根尖片證實有鄰面牙槽骨吸收；(3)口內余留牙≥20顆；(4)無正畸治療史；(5)患者除患牙周炎外全身健康，無糖尿病、心血管疾病和血液疾病等系統性疾病；女性未懷孕及哺乳。

本研究在開始前已獲得北京大學生物醫學倫理委員會審查批準(批準號：0313)，所有受試者納入前均簽署知情同意書，完成問卷調查，包括身高、體質量、吸煙史、全身健康狀況等。

1.2 牙周臨床檢查和影像學檢查

所有臨床檢查均由高年資醫生完成，檢查內容包括：(1)菌斑指數；(2)除第三磨牙外的每顆牙齒6個位點(近中頰、頰側中央、遠中頰、近中舌、舌側中央和遠中舌)的PD、臨床附著喪失(attachment loss，AL)；(3)每顆牙近中頰、頰側中央、遠中頰、舌側4個位點的出血指數(bleeding index，BI)。

所有研究對象均在北京大學口腔醫院放射科拍攝全口根尖X線片(采用分角線投照技術，每人14張)， 將全口根尖X線片掃描后存入電腦(確保X線片比例不變)。

1.3 GAgP患者骨代謝和牙根發育相關基因SNPs的檢測

所有受試者采取空腹前臂靜脈血10 mL，放入含有乙二胺四乙酸抗凝劑的真空管中，12 000轉離心5 min，留取白細胞層，-70 ℃凍存。采用上海華舜生物工程有限公司DNA提取試劑盒從白細胞中提取總基因組DNA，紫外分光光度計測定濃度和純度，D260 nm/D280 nm為1.8～2.0，-20 ℃保存。根據近十年的文獻報道和GenBank的檢索信息[12-16]，共篩選和分析了9個與骨代謝和牙根發育相關基因的13個SNPs位點(表1)。SNPs基因型鑒定是由上海邃志生物科技有限公司利用美國Sequenom公司的MassARRAY 系統完成。為了確保分型結果的準確性，對其中3個樣本39個位點的SNPs分型進行了重復檢測。

表1 納入研究的9個基因及13個SNPs位點

1.4 牙根形態異常的評估

參照徐莉等[6]、LV等[25]的研究，根據X線片表現將牙根形態異常分為6類：(1)錐根：牙根從根頸1/3即變窄，平面觀似三角形，牙根細且短，常見于前牙和雙尖牙。當根寬度參照值滿足以下條件時，可判斷為椎根：上中切牙<0.67；上側切牙<0.50；下切牙<0.34；上前磨牙<0.39；下前磨牙<0.42(圖1A、B)。(2)細長根：牙根細，呈桿狀，多見于下前牙(圖1C)。(3)冠根比例失調：冠長和根長的比值不同于正常牙。當冠根比滿足以下條件時，可判斷為冠根比例失調：上中切牙>0.81；上側切牙>0.90；下切牙>0.80；前磨牙>0.80(圖1D)。(4)彎曲根：前牙和雙尖牙可見牙根呈明顯彎曲，根尖彎曲部與牙長軸呈15°角以上(圖1E)。(5)融合根：磨牙的牙根融合后似單根牙，多見于上、下頜的第二磨牙(圖1F)。(6)后牙根形態異常：后牙牙根過短或過細(圖1G)。由4位有經驗且已經校準的醫師在不知患者基因型的(盲法)情況下，閱讀X線片，對牙根形態異常狀況進行判定。

A, cone-rooted teeth of anterior; B, cone-rooted teeth of premolar; C, slender-root teeth; D, short-rooted teeth; E, curved-rooted teeth; F, syncretic-rooted molars; G, molar root abnormalities.

1.5 統計學分析

采用SPSS 25.0軟件，對患者水平和牙水平進行統計分析。計量資料服從正態分布時以均數±標準差表示，不服從正態分布時以中位數(P25，P75)表示。不同基因型牙根形態異常數量的比較：(1)如果數據服從正態分布且具備方差齊性，采用獨立樣本t檢驗；(2)如果數據服從正態分布但不具備方差齊性，采用校正獨立樣本t檢驗；(3)如果數據不服從正態分布，則運用非參數檢驗Mann-WhitneyU檢驗；(4)對多組數據間的比較，如果數據服從正態分布且方差齊，采用單因素方差分析；如果數據不服從正態分布，則采用Kruskal-WallisH檢驗進行分析。不同基因型根形態異常發生率的比較：將同一位點根形態異常發生率差異無統計學意義的兩基因型合并為一組后進行多因素Logistic回歸分析，計算調整比值比(odds ratio，OR)。雙側P<0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

共納入179例GAgP患者，其中男 ∶女=67 ∶112，平均年齡(27.23±5.19)歲。平均口內存留牙為(26.80±1.84)顆(20～28顆)，平均PD為(4.85±0.98) mm，平均AL為(4.44±1.30) mm，平均BI為3.54±0.45。

2.2 牙根形態異常總體分布狀況

179例GAgP患者口內存留牙共計4 798顆，其中存在牙根形態異常的合計695顆，根形態異常構成比為14.49%，平均(3.88±3.84)顆。在6種類型的牙根形態異常中，前牙和雙尖牙錐根較為常見(表2)。

表2 牙根形態異常牙的分布狀況

2.3 13個SNPs位點不同基因型根形態異常牙分布

在篩選的9個與骨代謝和牙根發育相關基因的13個SNPs位點中，經過統計分析，VDR rs2228570及CTR rs2283002位點不同基因型牙根形態異常數量存在差異，其余SNPs位點不同基因型根形態異常牙的數量及發生率差異無統計意義(表3、4)。

2.3.1VDR rs2228570位點與牙根形態異常 VDR rs2228570位點CC、CT、TT基因型患者的牙根形態異常數量分別為(4.66±4.10)、(3.71±3.93)、(2.68±2.68)顆。CC基因型患者的牙根形態異常數量顯著高于TT基因型者，差異具有統計學意義(P=0.01)。同時該位點CC基因型患者的前牙錐根數量顯著高于TT基因型，差異具有統計學意義(P=0.02，表3)。CC基因型典型根形態異常患者全口根尖片見圖2，CC基因型患者根形態異常發生率高于CT和TT基因型，但差異無統計學意義(表4)。

2.3.2CTR rs2283002位點與牙根形態異常 CTR rs2283002 TT、CT、CC基因型患者的牙根形態異常數量分別為(3.05±3.12)、(3.43±3.95)、(5.02±3.70)顆。CC基因型患者的牙根形態異常數量顯著高于與TT和CT基因型，差異具有統計學意義(P=0.03，表3)。22例TT基因型患者中有14例發生根形態異常，95例CT基因型患者中有62例發生根形態異常，49例CC基因型患者中有43例存在根形態異常，根形態異常發生率分別為63.64%、65.26%、87.86%，校正年齡、性別后，CC基因型的根形態異常發生率顯著高于CT及CC基因型(adjustedOR=3.71，95%CI：1.45～9.50,表4)。

3 討論

牙根形態異常在我國GAgP患者中發生率高，是牙周病發生發展的重要危險因素之一。本研究采用分角線投照技術拍攝的X線片來觀察牙根形態，與以往研究相同，田雨等[26]的研究比較了在X線片和在離體牙上測得的冠根比例，結果差異無統計學意義，證明使用分角線投照技術觀察牙根形態是可靠的。本研究中GAgP患者在牙水平存在根形態異常的比例為14.49%，與以往研究相當[6]。牙根的發育主要是口腔上皮組織和外胚間充質相互作用的結果，某些生物分子在時限、活性強度等方面協調發揮作用，影響牙齒發育，但是目前尚未見牙根形態異常發生的遺傳學研究。故本研究根據近十年的文獻報道和GenBank的檢索信息[12-16]，篩選了與骨代謝和牙根發育相關的9個基因的13個SNPs位點，分析不同基因型牙根形態異常的差異，初步發現與牙根形態異常發生相關的基因位點為VDR rs2228570位點和CTR rs2283002位點。

表3 GAgP患者9個基因13個SNPs位點不同基因型與牙根形態異常

Male, 21 years, VDR rs2228570 CC genotype；Cone-rooted teeth of anterior: 11， 21, 32, 31, 41, 42; Curved-rooted teeth: 12, 22; Molar root abnormalities: 36, 46.

表4 GAgP患者9個基因13個SNPs位點不同基因型根形態異常發生率

Berdal等[27]通過免疫細胞化學法觀察VDR在大鼠切牙牙胚中的分布, 發現在牙胚發育過程中VDR在所有祖細胞中均有表達, 并在分化過程中逐漸減少, 成釉細胞和成牙本質細胞是1, 25-二羥維生素D3 [(1,25(OH)2D3]的靶細胞。Papagerakis[28]采用電子顯微鏡及Northern blot方法研究大鼠，發現釉原蛋白的表達受1,25(OH)2D3調控，在維生素D(vitamin D，VD)缺乏大鼠切牙牙胚中釉原蛋白表達降低, 而單獨注射VD后釉原蛋白表達增加。Onishi[29]也發現1,25(OH)2D3可通過調節鈣結合蛋白的基因表達而影響牙齒的礦化過程。Bailleul-Forestier等[30]采用免疫熒光技術發現在人類牙胚分化的成釉細胞和成牙本質細胞的細胞核可以檢測到VDR和鈣結合蛋白D28k分布，提示1,25(OH)2D3可能有助于調節牙釉質和牙本質的形成，這些研究提示VDR可能與牙根發育有關。

VDR是一種配體激活的轉錄因子， VD與VDR結合可促進基因(如釉原蛋白基因、牙本質磷蛋白基因等)表達，形成各種細胞外基質蛋白，如成釉蛋白、牙本質磷蛋白等，參與牙本質和牙釉質的形成[31]。VDR基因位于12號染色體長臂q13-14區，有11個外顯子，rs2228570位點在第二外顯子區[32]。rs2228570位點的等位基因C突變為T時，可以產生一個新的起始密碼子，導致VDR氨基酸鏈增加3個氨基酸[33]。盡管Gross 等[34]的研究顯示該基因位點多態性不影響VDR基因轉錄以及VDR配體親和力，但也有研究發現該基因位點突變會致使VDR基因轉錄活性降低[35-36]。Liu等[37]發現該位點CC型可能會增加侵襲性牙周炎的患病風險(OR=2.45)， 以往很多研究也發現該基因型可能會增加廣泛型侵襲性牙周炎的患病風險[2,38]。本研究結果顯示, 該位點CT基因型GAgP患者平均根形態異常數量比CC基因型患者平均少0.9顆，TT基因型患者平均根形態異常數量比CC基因型患者平均少2.0顆，兩者差異有統計學意義，這表明rs2228570位點的等位基因T可能對阻止牙根形態異常的發生呈弱保護作用。CC基因型可能會導致GAgP根形態異常數量增加，造成牙根解剖形態缺陷，與其他多種因素共同導致GAgP患者嚴重的牙周組織破壞。

CTR rs2283002位點CC基因型GAgP患者平均根形態異常數量為(5.02±3.70)顆，大于CT基因型和TT基因型患者。此外，發現CC基因型患者的根形態異常發生率高于TT和CT基因型(adjustedOR=3.71，95%CI：1.451～9.500)，表明CTR基因rs2283002位點可能與GAgP患者牙根形態異常有關。降鈣素受體基因位于染色體長臂7q21.3，目前發現有11個單核苷酸多態性位點，rs2283002位點位于內含子區域[39-40]。Giroux等[41]發現rs2283002位點基因多態性與下腰椎骨密度有關，但Yanovich等[42]和Xiong等[39]的研究未發現該位點基因多態性與骨密度有關。既往關于降鈣素受體基因與牙齒發育關系的研究較少，Mallek等[17]對新生大鼠切牙和磨牙牙胚進行了一項體外實驗，體外培養條件分為正常營養組和營養缺乏組，結果顯示降鈣素能明顯抑制正常大鼠牙胚的鈣吸收，而增加了營養不良大鼠牙胚的鈣吸收，而上述作用是發生在牙胚發育早期。Sakakura等[18]用不同濃度降鈣素體外培養小鼠第一磨牙牙胚，發現較低濃度的降鈣素能促進成牙本質細胞提前分泌前期牙本質，而較高濃度降鈣素則會抑制前期牙本質的形成，這提示當CTR基因表達增強時，降鈣素可通過與CTR結合而發揮抑制牙本質形成，從而影響牙根發育。

綜上所述，本研究提示VDR rs2228570位點和CTR rs2283002位點可能與GAgP患者牙根形態異常的發生有關，為進一步探究廣泛型侵襲性牙周炎患者根形態異常的發生和致病機制打下基礎。同時本研究也存在一些局限，在觀察牙根形態時使用了分角線投照技術，可能采用平行投照更為準確；同時本研究缺乏健康對照組，所研究的位點較少，需探索更多與牙根發育可能有關的基因位點。