谷子MRP蛋白家族序列特征、分子進化及表達模式分析

高豪 滿夏夏 孫朝霞 韓淵懷 李紅英 侯思宇 郭數進

摘要：本研究旨在深入了解谷子葉酸轉運家族成員的基因結構和表達模式，為谷子體內葉酸轉運分子機制的研究奠定基礎。使用Phytozome、Clustal X、MEGA7.0等在線工具和軟件，對谷子MRP家族成員進行生物信息學分析；基于谷子谷穗有參轉錄組測序數據，分析谷子MRP家族成員表達模式。結果顯示，谷子MRP蛋白家族成員共21個，在7號染色體分布最多，有8個基因；17個谷子MRP蛋白偏堿性和4個偏酸性，根據疏水值判斷其均為親水性蛋白；成員SiMRP7、SiMRP12基因的表達量與谷子組織中的總葉酸含量表現出協同降低的趨勢，推測這兩個蛋白可能對谷子葉酸的積累起到調控作用。本研究有助于進一步鑒定葉酸轉運相關蛋白，為后續研究葉酸代謝途徑及谷子基因挖掘提供了理論基礎。

關鍵詞：谷子；MRP蛋白家族；谷子葉酸；生物信息學分析；表達模式

中圖分類號：S515文獻標志碼：A論文編號：cjas2020-0059

MRP Protein Family of Foxtail Millet： Analysis of Sequence Characteristics， Molecular Evolution and Expression Pattern

Gao Hao， Man Xiaxia， Sun Zhaoxia， Han Yuanhuai， Li Hongying， Hou Siyu， Guo Shujin

（College of Agriculture， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， Shanxi， China）

Abstract： The aims are to study the gene structure and expression patterns of folate transport family members， and establish the foundation for exploring the molecular mechanism of folate transport in foxtail millet. Bioinformatics analysis of MRP family members was carried out with Phytozome， Clustal X， MEGA7.0 and other online tools and software. Based on the transcriptome sequencing data of foxtail millet， the expression patterns of foxtail millet MRP family members were analyzed. The results show that there are 21 foxtail millet MRP protein family members， most of which are distributed on chromosome 7， with 8 genes； 17 MRP proteins are alkaline and 4 proteins are acidic， and they are all hydrophilic proteins according to the hydrophobic value. The expression of SiMRP7 and SiMRP12 genes and the total folate content in foxtail millet tissue have a synergistic decrease trend， and these two proteins might play a regulatory role in the accumulation in foxtail millet. This study further identifies folate transport-related proteins， and could provide a theoretical basis for future research on folate metabolism pathway and gene mining.

Keywords： Foxtail Millet； MRP Protein Family； Folate of Foxtail Millet； Bioinformatics Analysis； Expression Pattern

0引言

谷子（Setaria italic）為禾本科植物，籽粒脫殼后被稱為小米，產于中國北方地區[1]。作為農耕文明的一部分，曾是中國北方人民主要的糧食作物，在某種程度上決定了先民們的生產與生活方式[2]。隨著生活水平的提高，人們開始追求健康和營養均衡的飲食，小米的營養保健和食療價值都非常高，可以充分滿足消費者對食品營養的需求。葉酸存在于各種動物性食品、糧食作物和綠色蔬菜中[3]，是生物體內不可缺少的有機物質[4-5]，也是食物成分表中有待補充的重要營養成分之一[6-7]，人體不能自身合成葉酸，只有從膳食中攝取，糧食和蔬菜是人類葉酸的主要來源[8-9]。葉酸還具有補血，促進嬰幼兒大腦的發育等功能，缺乏葉酸會導致神經衰弱、貧血、癌癥等多種疾病[10-12]。

目前，全世界都廣泛存在葉酸缺乏問題，中國也面臨著嚴重的葉酸缺乏問題。據上海市閔行區婦幼保健院孕前門診在備孕夫妻中進行的橫斷面調查，結果顯示，總體人群膳食葉酸平均水平為296.3μg/d，男性為327.3μg/d，女性為267.2μg/d，低于成人400μg/d的推薦攝入量[13]。侯思宇等[14]建立了一種高效測定谷子籽粒葉酸的HPLC方法，同時測定了45份種質的葉酸含量，其平均葉酸含量最高達1.84μg/g，含量最高的種質的葉酸含量達到了2.86μg/g。邵麗華[15]測定了山西281份谷子種質資源的小米和36種主要糧食作物、常見水果和蔬菜的總葉酸含量，發現小米葉酸含量在糧食和蔬菜作物中屬于較高水平，只略低于新鮮水果。

MRP蛋白（Multidrug resistance-associated protein）家族是跨膜轉運蛋白超家族ABC家族的成員之一，其轉運底物包括多糖、多肽、重金屬螯合物、生物堿和藥物等[16]。研究表明，玉米bronze-2 （bz2）突變體由于缺失bz2基因編碼的一種谷胱甘肽S-轉移酶，導致花色素苷不能在液泡中積累。因谷胱甘肽S-轉移酶對MRP轉運蛋白結合底物的活性有很重要影響，推測在玉米bz-2突變體中，MRP型ABC轉運蛋白很可能參與花色素苷轉運過程[17]。ZmMrp3是從玉米中克隆的一個編碼ABC轉運蛋白，定位在液泡膜上，是花色素苷轉運至液泡中積累所必須的，而ZmMrp4轉運蛋白也參與了花色素苷的積累過程，但在糊粉層組織大量表達[18]。王璐[19]以瓜葉菊藍色、洋紅色、黃色、粉色、白色5個色系植株為試驗材料，利用RT-PCR技術分析瓜葉菊MRP亞家族14個不同成員在舌狀花發育最初的2個階段的表達模式，發現ScMRP1在不含花青素苷的黃色、白色系瓜葉菊中低表達，而在含有花青素苷的藍色、洋紅色、粉色系瓜葉菊中高表達，推測ScMRP1可能與瓜葉菊花青素苷轉運相關。Garza等[20- 21]和Storozhenko等[22]發現，AtMRP1參與四氫葉酸的轉運過程，在葉酸生物合成中起重要作用。

小米與其他大宗糧食比較，不僅營養豐富全面，而且具有特殊的醫療保健功能，所以深受國民尤其是中老年人的喜愛，更是產婦補身催乳的必備食品[23]。隨著生活水平和習慣的變化，人們對健康飲食的需求越來越高，小米是優秀的營養保健和食療食品，富含葉酸等營養物質，可以滿足消費者均衡營養的需求。因全世界普遍存在的葉酸缺乏問題，葉酸的生物強化已成為一個新的研究熱點，然而當前關于谷子富集葉酸的分子機制尚不清楚，尤其是葉酸代謝途徑的關鍵基因的序列特征和表達模式尚無人報道。本研究利用生物信息學相關技術鑒定谷子的MRP基因家族并對該家族的序列特征、分子進化及表達模式進行分析，以期為谷子葉酸轉運相關基因的研究和作物的葉酸生物強化研究提供一定的參考。

1材料與方法

1.1谷子MRP家族成員的序列提取及理化性質分析

在Pfam網站（http：//pfam.xfam.org/）中查找MRP家族的保守域序列號（PF00005，PF00664）。在Phytozome網站（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）下載基因位置信息。使用ProtParam網站（https：//web. expasy.org/protparam/）計算氨基酸理化參數。

1.2谷子MRP家族蛋白系統進化樹的構建

使用Clustal X進行序列比對，在TAIR網站（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp）下載擬南芥（Arabidopsis thaliana）MRP蛋白序列；在RGAP數據庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）下載水稻（Oryza sativa）MRP蛋白序列；在MEGA7.0中使用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建谷子、擬南芥和水稻的系統進化樹。

1.3谷子MRP家族的蛋白質保守序列

利用MEME在線工具（http：//meme-suite.org/）對谷子的MRP家族蛋白質保守基序進行分析，基序長度范圍設為10～50個，基序最大發現數目設為10個，其他設為默認值。

1.4谷子MRP家族的蛋白質的二級結構、三級結構

使用SOPMA網站（https：//npsa- prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）進行蛋白質二級結構預測，SWISS-MODLE服務器（https：// swissmodel.expasy.org/）進行蛋白質三級結構預測。

1.5谷子MRP家族成員表達模式分析

對谷子S1、S3、S5時期的穗部組織樣品進行有參轉錄組測序，結合谷子S1、S3、S5時期的穗部組織總葉酸含量，根據谷子MRP家族成員在各時期的表達量，對谷子MRP家族成員的表達模式進行分析。

2結果與分析

2.1谷子MRP家族基因信息及理化性分析

鑒定出21個谷子MRP家族的基因，根據基因在染色體上的位置分布，按順序對基因進行了命名，為SiMRP1-SiMRP21（表1）。基因序列長度范圍在4413（SiMRP6）～17930（SiMRP10），蛋白序列長度范圍在635（SiMRP5）～1609（SiMRP10）。其中氨基酸數目大于1300和小于1300的蛋白數目各為11個和10個，除了編碼氨基酸數目最小的SiMRP5，其余MRP氨基酸數目跨度較小。對MRP蛋白理論等電點進行分析，結果表明，其中SiMRP14編碼蛋白的等電點最小，為5.38，表現為酸性；SiMRP7編碼蛋白的等電點最大，為9.32，表現為堿性。表現為堿性的蛋白有17個，表現為酸性的蛋白有4個，說明谷子MRP蛋白含有較多的堿性氨基酸和較少的酸性氨基酸。

對MRP蛋白的不穩定系數進行分析，結果表明， 21個蛋白的不穩定系數介于35.65～45.28，其中不穩定系數大于40的蛋白數目為9個，小于40的蛋白數目為12個，表現為不穩定蛋白的數目超過百分之五十。氨基酸的疏水性數值介于0.026～0.276，均為正值，表明谷子MRP蛋白均表現為親水性（表1）。

MRP家族基因分別位于7條染色體上。其中有8個基因分布在7號染色體（Chr7），數目最多，其次是Chr1，有7個基因分布其上。剩余基因分布在其他6條染色體上（圖1）。

2.2谷子MRP家族蛋白系統進化樹分析

為了研究谷子MRP基因家族蛋白之間的親緣關系，使用鄰接法對谷子與擬南芥、水稻，3個物種共52個MRP蛋白序列進行分析，構建了系統進化樹（圖2）。根據谷子MRP家族系統進化樹的分支情況，可以將谷子MRP蛋白成員分為兩個進化分支，即ClassⅠ和ClassⅡ。進化樹顯示2個分支之間的蛋白質數量差距不大，其中ClassⅠ包含11個蛋白，成員為SiMRP1、SiMRP2、SiMRP3、SiMRP4、SiMRP5、SiMRP6、SiMRP7、SiMRP8、SiMRP12、SiMRP18、SiMRP20；ClassⅡ包含10個蛋白，分別為SiMRP9、SiMRP10、SiMRP11、SiMRP13、SiMRP14、SiMRP15、SiMRP16、SiMRP17、SiMRP19、SiMRP21。所有擬南芥和水稻MRP家族成員都聚類到了ClassⅡ中。從進化樹的聚類分析可見，蛋白結構域相似的以及同源度高的蛋白聚在一起，如SiMRP1和SiMRP2，SiMRP16和SiMRP17，SiMRP18和SiMRP20，SiMRP21和OsMRP13，SiMRP11和OsMRP2聚類到了一起，通過蛋白序列比對發現SiMRP1和SiMRP2的同源性為82.51%，SiMRP16和SiMRP17的同源性為96.87%，SiMRP18和SiMRP20的同源性為86.73%，推測它們有較相似的功能。

2.3谷子MRP家族蛋白質結構域及保守基序分析

利用MEME對谷子的MRP家族21個蛋白質保守基序進行分析，結果表明，在MRP家族蛋白中，一共發現了10個保守基序（motif）（圖3）。其中，SiMRP1、SiMRP2、SiMRP3具有完全相同的motif排列，SiMRP19、SiMRP20具有完全相同的motif排列，SiMRP16、SiMRP17具有完全相同的motif排列；有15個MRP蛋白的最后4個motif排列順序是相同的，順序為motif 10、motif 2、motif 3、motif 6；除了SiMRP5，所有成員的蛋白保守序列的倒數第3、4個motif都為motif 10、motif 2，這兩個motif的排列順序是固定不變的；圖中顯示這10個保守基序的氨基酸序列（圖4）。

2.4谷子MRP家族蛋白質的二級結構、三級結構分析

利用SOPMA對谷子MRP家族的二級結構進行預測。蛋白質的二級結構包括無規則卷曲，延伸鏈，α螺旋，β折疊。谷子MRP家族在這4項中差別不大（表2），α螺旋最大為55.70%，最小為47.36%；延伸鏈最大為17.34%，最小為13.86%；β折疊最大為9.92%，最小為4.30%；無規則卷曲最大為30.82%，最小為 22.36%。根據MRP家族系統進化樹結果，選擇SiMRP1、SiMRP2、SiMRP8三個成員繪制蛋白質的二級結構和三級結構圖，蛋白質的二級結構（圖5）不但在某些方面上決定了蛋白質的三維結構，而且對蛋白質功能的預測有一定的幫助。

SiMRP1的α螺旋為52.33%，β折疊為5.71%，延伸鏈為17.20%和無規則卷曲為24.76%；SiMRP2的α螺旋為50.56%，β折疊為6.00%，延伸鏈為17.04%和無規則卷曲為26.40%；SiMRP8的α螺旋為50.28%，β折疊為6.04%，延伸鏈為17.24%和無規則卷曲為26.45%。這3個蛋白質的α螺旋，β折疊，延伸鏈和無規則卷曲的數值相差不大，蛋白的三維結構有一些的差別（圖6）。

2.5谷子MRP家族成員表達模式分析

為進一步了解MRP家族成員的特性和功能作用，對其組織特異表達情況進行分析。所有的成員在谷子的S1、S3、S5時期組織中均有表達，SiMRP2在S1時期表達量最低，fpkm值為0.014，SiMRP10在S1時期表達量最高，fpkm值為46.013，SiMRP3在S3時期表達量最低，fpkm值為0.021，SiMRP21在S3時期表達量最高，fpkm值為38.654，SiMRP3在S5時期表達量最低，fpkm值為0.017，SiMRP21在S5時期表達量最低，fpkm值為33.164（圖7）。其中SiMRP7、SiMRP9、SiMRP10、SiMRP12、SiMRP13、SiMRP18、SiMRP19、SiMRP20和SiMRP21在每個時期的表達量都很高，暗示著這9個基因有可能發揮多方面作用。不同的基因在不同時期表達量差異很大，如SiMRP7在S1時期的表達值是其在S5時期的2.42倍，SiMRP12在S1時期的表達值是其在S5時期的3.55倍，SiMRP10在谷子S1時期表達值最高，SiMRP21在S3、S5時期表達值都最高。結合谷子S1、S3、S5時期的谷子穗部組織總葉酸含量（圖8），發現SiMRP7、SiMRP12基因的表達量與谷子組織中的總葉酸含量表現出協同降低的趨勢，其基因在谷子不同時期的表達差異及功能機制還需要進一步研究。

3討論與結論

谷子在中國具有長久的種植歷史，是中國人民的傳統糧食作物，在古代，它曾被作為中國北方主要糧食作物來種植，是中國北方人民喜愛的食物。隨著社會的發展，谷子由于它豐富的營養、獨特的風味，正日漸成為全國人民都喜愛的健康食物。谷子籽粒脫皮后被成為小米，其富含豐富的營養物質，包括多種維生素、蛋白質、脂肪、糖類及鈣、磷、鐵等人體所必需的營養物質，同時還具有一定的藥用價值[24]。因谷子營養豐富，尤其富含葉酸，所以對谷子營養成分的富集機制的研究逐漸引起科學家的注意，谷子葉酸富集機制的探究更是成為一個新的研究熱點。

目前谷子MRP蛋白家族的鑒定和系統分析尚未見報道，本研究對谷子MRP蛋白家族進行鑒定，并進行了一系列生物信息學分析。得到谷子的MRP家族一共有21個成員，并對該族蛋白序列進行了基序分析，發現谷子MRP蛋白家族具有保守性較高的特點。其一級結構之間和二級結構之間較為相似，三級結構之間的差異說明在進化的過程中這些蛋白序列發生了功能上的差異。谷子中親緣關系較近的MRP蛋白一般具有相似的基因結構和蛋白結構域，如SiMRP18和SiMRP20蛋白的親緣關系很近，其蛋白結構域也很相似，推測這對MRP基因很有可能來源于同一祖先基因，是基因復制的結果。SiMRP21和OsMRP13，SiMRP11和OsMRP2聚類到了一起，推斷它們可能具有較高的同源性和較為相似的功能。在21個成員中共發現的10個保守基序，其中Motif 6和Motif 3非常相似，這可能會對結果造成一定的偏差。

研究表明，由MRP家族介導的氨甲喋呤（MTX）能通過競爭性抑制DHFR，阻斷二氫葉酸（FH2）合成四氫葉酸（FH4），導致細胞內四氫葉酸不足[25- 26]。同時，AtMRP1也參與了到葉酸生物合成途徑中的四氫葉酸的轉運過程中[20-22]，而SiMRP7、SiMRP12基因的表達量與谷子組織中的總葉酸含量表現出協同降低的趨勢，推測這兩個蛋白可能對谷子葉酸的積累起到調控作用。由此可以推斷，谷子MRP蛋白家族很可能參與到了谷子葉酸的合成途徑中，它可能在谷子葉酸合成途徑中扮演了重要的角色。目前對MRP蛋白家族的研究主要集中在動物、癌癥、藥物領域，在植物領域中的研究比較少見，與谷子葉酸的合成途徑的關系也未探明，因此本研究針對谷子MRP蛋白家族序列特征、分子進化及表達模式的分析有助于進一步探究谷子葉酸的合成途徑，為挖掘谷子葉酸調控相關基因資源提供理論依據，為后續分子育種奠定基礎。

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