基于GC-MS技術(shù)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討醒腦靜注射液入腦成分抗腦缺血損傷的作用機(jī)制

吳京霓，劉瑞敏，許丹妮，李玥璇，常中滿，郝佳雪，賈 璞，廖 莎，鄭曉暉

西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069

腦卒中是一種急性腦血管疾病，是我國(guó)成年人群致死、致殘的首位病因，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)[1]。腦卒中可分為缺血性和出血性卒中，其中缺血性腦卒中占比85%以上[2]。眾所周知，腦缺血損傷機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括興奮毒性、自由基損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等[3]。化學(xué)藥主要通過(guò)神經(jīng)保護(hù)、抗炎、清除自由基等途徑來(lái)治療腦缺血，但結(jié)果不盡人意。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)的特點(diǎn)，在治療復(fù)雜的腦缺血疾病中具有優(yōu)勢(shì)；臨床用藥大多數(shù)為中藥制劑，如補(bǔ)陽(yáng)還五湯、四君子湯、醒腦靜注射液等[4]。

醒腦靜注射液（簡(jiǎn)稱醒腦靜）是經(jīng)典涼開(kāi)方劑安宮牛黃丸的減方，是由麝香Moschus、冰片Borneolum Syntheticum、梔子Gardeniae Fructus、郁金Curcumae Radix4 味藥材經(jīng)過(guò)2 次水蒸氣蒸餾法制得[5-6]。臨床上其常用于氣血逆亂、腦脈瘀阻所致的中風(fēng)昏迷、偏癱口喎等的治療。研究表明，醒腦靜能減輕意識(shí)障礙嚴(yán)重程度、改善神經(jīng)功能缺損癥狀，并能加強(qiáng)日常生活活動(dòng)[7-8]；還可降低腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障通透性[9]，緩解再灌注損傷引起的各種炎癥反應(yīng)[10]，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及自噬[11-12]。但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)仍然不明，質(zhì)量不可控，嚴(yán)重限制其臨床應(yīng)用[13]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合多個(gè)學(xué)科，結(jié)合多種高新技術(shù)平臺(tái)、軟件，將數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，從而直觀闡述中藥復(fù)方與復(fù)雜疾病之間的關(guān)聯(lián)，也能充分體現(xiàn)中藥及其復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的優(yōu)勢(shì)[14]。血腦屏障（blood brain barrier）為正常的神經(jīng)元功能和突觸傳遞維持安全穩(wěn)定的環(huán)境，相反，血腦屏障也是藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要障礙[15]。因而本研究擬采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（ gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）識(shí)別醒腦靜入腦成分，同時(shí)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，探索醒腦靜治療腦缺血藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在分子機(jī)制，為其臨床使用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器及試劑

醒腦靜注射液（批號(hào)1909032），大理藥業(yè)有限公司；GCMS-TQ8040 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、SH-Rxi-5Sil 弱極性色譜柱（日本島津公司）；正己烷（色譜級(jí)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性8 周齡左右SD 大鼠，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（陜）2018-001，體質(zhì)量（240±20）g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究中心提供。購(gòu)回后適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，實(shí)驗(yàn)間飼養(yǎng)環(huán)境的溫度為（25±1）℃，濕度（55±5）%。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方案都通過(guò)了西北大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)，所有程序均符合相關(guān)道德規(guī)范，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理證明決議編號(hào)：NWU-AWC-20190102M。

1.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）；Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/）；CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ctdbase.org/）；PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.drugbank.ca/）；STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）；OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/）；GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）；DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.disgenet.org/）。R 語(yǔ)言R-3.6.3 軟件、Cytoscape3.7.2 軟件、MOE Dock 軟件、Venny 2.1軟件；Uniprot（https://www.uniprot.org/）；OmicShare（https://www.omicshare.com/）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、給藥及樣品處理

SD 雄性大鼠20 只，自由飲水和進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組（2 只）和給藥組（8 只），對(duì)照組尾iv 生理鹽水0.5 mL/100 g、給藥組尾iv 醒腦靜1.5 mL/100 g，給藥后于枕骨大孔處抽取腦脊液。

將空白腦脊液、給藥后腦脊液12 000 r/min、4℃離心10 min，取上清；然后分別用與上清等倍量正己烷溶劑萃取醒腦靜、空白腦脊液、給藥后腦脊液。渦旋2 min 后，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清氮?dú)獯蹈桑?20 ℃保存。將上述得到樣品用150 μL 正己烷溶液復(fù)溶，0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，用于GC-MS 分析。

2.2 分析條件

2.2.1 色譜條件 采用島津SH-Rxi-5Sil 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.32 μm），進(jìn)樣量為2 μL，分流比6∶1，體積流量1.6 mL/min，進(jìn)樣口溫度250℃，F(xiàn)ID 檢測(cè)器溫度280 ℃，載氣為高純He、H2（99.999%）。升溫程序：初始溫度70 ℃，以2 ℃/min升溫至110 ℃；以5 ℃/min 升溫至150 ℃；以1℃/min 升溫至180 ℃。

2.2.2 質(zhì)譜條件 四級(jí)桿溫度250 ℃、溶劑延遲時(shí)間2 min，質(zhì)量掃描模式全掃描，掃描范圍：m/z50～500。比較質(zhì)譜碎片圖譜與NIST14 質(zhì)譜庫(kù)，鑒別醒腦靜成分及其入腦成分。

2.3 醒腦靜入腦成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

調(diào)研文獻(xiàn)獲取醒腦靜入腦成分，并通過(guò)GC-MS分析對(duì)其進(jìn)行補(bǔ)充[16-17]。運(yùn)用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取成分的3D 結(jié)構(gòu)，將其導(dǎo)入TCMSP[18]和Swiss Target Prediction[19]數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，合并2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)信息。最后采用Uniprot 平臺(tái)將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化成“Gene Symbol”[20]。

2.4 疾病靶點(diǎn)的查詢

通過(guò)CTD、OMIM、GeneCards、DisGeNET、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)分別搜索“cerebral ischemia”，合并各數(shù)據(jù)庫(kù)疾病靶點(diǎn)，去重后得到腦缺血疾病靶點(diǎn)。

2.5 藥物與疾病共有靶點(diǎn)

將上述得到的藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)上傳至Venny 2.1 軟件構(gòu)建韋恩圖。將得到的藥物與疾病共有靶點(diǎn)傳至STRING[21]平臺(tái)，選擇蛋白種屬“Homo sapiens”，構(gòu)建藥物與疾病共有靶點(diǎn)間蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。并采用R-3.6.3 軟件對(duì)其核心靶點(diǎn)進(jìn)行可視化。

2.6 基因本體（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集可視化

將藥物與疾病共有靶點(diǎn)通過(guò)Uniprot 轉(zhuǎn)化成“ensembl”格式，上傳至OmicShare 云平臺(tái)進(jìn)行GO、KEGG 富集及可視化[22]。

2.7 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述得到的醒腦靜入腦成分、治療腦缺血靶點(diǎn)、涉及通路上傳至Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

2.8 分子對(duì)接驗(yàn)證

從PDB（Protein Data Bank）數(shù)據(jù)庫(kù)下載靶點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)，隨后采用MOE Dock 軟件將靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的入腦成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證[23]。

3 結(jié)果

3.1 醒腦靜入腦成分匯總及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

為了得到更全面的醒腦靜入腦成分，在調(diào)研文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，基于上述分析條件對(duì)醒腦靜及其入腦成分進(jìn)行定性分析，共得到13 種入腦成分。其中梔子苷、梔子苷酸、京尼平龍膽雙糖苷3 種成分均由文獻(xiàn)查詢獲得[16]。GC-MS 得到龍腦、麝香酮、莪術(shù)二酮等10 種原注射液入腦成分，總離子流圖見(jiàn)圖1，結(jié)果見(jiàn)表1，各成分質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2，13 種入腦成分歸屬見(jiàn)表2。運(yùn)用TCMSP、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)13 種入腦成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，共得到基于入腦成分的237 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，提示醒腦靜入腦成分分布于4 味藥材，且均作用于多個(gè)靶點(diǎn)。

3.2 藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖1 醒腦靜成分、入腦成分GC-MS 總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion current diagram of Xingnaojing Injection components and brain absorption components

表1 GC-MS 測(cè)得醒腦靜入腦成分Table 1 Summary of brain absorption components of Xingnaojing Injection measured by GC-MS

為了更好地闡明藥物與疾病的關(guān)系及靶點(diǎn)間相互作用。通過(guò)CTD、OMIM、GeneCards 等數(shù)據(jù)庫(kù)得到1720 個(gè)腦缺血靶點(diǎn)，將上述得到的藥物靶點(diǎn)和腦缺血靶點(diǎn)取交集，得到93 個(gè)醒腦靜入腦成分治療腦缺血損傷的靶點(diǎn)，如圖3-A 所示。將藥物與腦缺血相關(guān)靶點(diǎn)上傳至STRING 平臺(tái)得到PPI 互作圖，如圖3-B 所示；并采用R 軟件對(duì)其進(jìn)行可視化處理，結(jié)果如圖3-C 所示；其中度（degree）值排名前30 靶點(diǎn)信息見(jiàn)表3，涉及靶點(diǎn)蛋白激B（protein activated B，AKT）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen activated protein kinase 3，MAPK3）、絲裂原活化蛋白激酶8（mitogen activated protein kinase 8，MAPK8）、前列腺素G/H 合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、內(nèi)型皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）等。提示醒腦靜入腦成分可能有93個(gè)直接作用于腦缺血損傷的靶點(diǎn)，度值越高的靶點(diǎn)可能在治療腦缺血損傷中越關(guān)鍵。

3.3 GO、KEGG 通路富集

為了更好地研究候選靶點(diǎn)涉及的機(jī)制，對(duì)其參與的基因功能和信號(hào)通路進(jìn)行富集分析。將93 個(gè)藥物與疾病共有靶點(diǎn)上傳至OmicShare 云平臺(tái)進(jìn)行GO、KEGG 富集及可視化，保留前25 條P值≤0.01 的KEGG 通路（pathway）進(jìn)行可視化分析，見(jiàn)圖4-A，排名較前的信號(hào)通路有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路、鞘脂信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號(hào)通路及白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號(hào)通路等，見(jiàn)表4。由此可見(jiàn)，富集的信號(hào)通路主要涉及神經(jīng)、血管、炎癥等方面，這與醒腦靜注射液功能主治開(kāi)竅醒腦相吻合，提示本研究的合理性。

GO 富集結(jié)果見(jiàn)圖4-B～D，分別從生物過(guò)程（biological process）、細(xì)胞組成（cellular component）、分子功能（molecular function）進(jìn)行注釋。其中生物過(guò)程主要涉及含氧化合物反應(yīng)、含氮化合物反應(yīng)、血液循環(huán)等，同時(shí)這些靶點(diǎn)與細(xì)胞組成中的神經(jīng)元、突觸膜、突觸前膜等密切相關(guān)；也涉及神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、核受體活性等分子功能。

圖2 醒腦靜入腦成分GC-MS 質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of brain absorption components of Xingnaojing Injection measured by GC-MS

表2 醒腦靜入腦成分歸屬Table 2 Summary of brain absorption components of Xingnaojing Injection

圖3 藥物與疾病共有靶點(diǎn)Venn 圖 (A)、PPI 圖 (B) 和可視化結(jié)果 (C)Fig.3 Venn diagram (A),PPI diagram (B) and visualization results (C) of common targets for drugs and diseases

表3 藥物與疾病共有靶點(diǎn)信息匯總 (前30)Table 3 Summary of common targets for drugs and diseases (Top 30)

續(xù)表3

3.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)構(gòu)建醒腦靜入腦成分與其治療腦缺血靶點(diǎn)及KEGG 通路網(wǎng)絡(luò)圖，可進(jìn)一步揭示入腦成分靶點(diǎn)的協(xié)同治療作用及治療腦缺血機(jī)制。如圖5 所示，13 種入腦成分靶點(diǎn)頻次較高的為莪術(shù)二酮（35）、新莪術(shù)二酮（31）、芳樟醇（27）、梔子苷（23）、麝香酮（19）等。入腦成分涉及腦缺血靶點(diǎn)93 個(gè)，其中4味藥材共有靶點(diǎn)有3個(gè)，環(huán)氧合酶類（COX-2、COX-1）及重組人碳酸酐酶-2（carbonic anhydrase 2，CA-2）；3 味藥材共有靶點(diǎn)有15 個(gè)，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARA）、eNOS、γ-氨基丁酸受體類（GABRA1、GABRB2）、單胺氧化酶類（MAO-B）、雌激素受體（estrogen receptor，ESR1）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor gamma，PPARG）、P2X 嘌呤受體7（P2X purinoceptor 7，P2X7）、聚[ADP-核糖]聚合酶1（poly [ADP-ribose] polymerase 1，PARP-1）等；2 味藥材共有靶點(diǎn)有27 個(gè)；梔子特有靶點(diǎn)25 個(gè)，郁金特有靶點(diǎn)13 個(gè)，麝香特有靶點(diǎn)6 個(gè)。在25 條通路中，4 味藥材入腦成分共同參與的有16 條，包括cAMP 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路等；其余9 條為郁金、梔子、麝香共同參與的通路，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路、叉頭盒O（FoxO）信號(hào)通路等。成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)揭示了入腦成分靶點(diǎn)協(xié)同治療作用及靶點(diǎn)與通路間相互作用，從而體現(xiàn)中藥復(fù)方的整體性的特點(diǎn)。

3.5 整合醒腦靜治療腦缺血通路

為了更好地理解醒腦靜注射液入腦成分治療腦缺血的整體調(diào)控，根據(jù)上述結(jié)果建立了一條整合的醒腦靜治療腦缺血通路，如圖6 所示。22 個(gè)靶點(diǎn)分別分布在整合通路的上下游，可被醒腦靜入腦成分直接靶向，表明醒腦靜可直接作用于這些靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用。醒腦靜的入腦成分通過(guò)調(diào)控鞘脂信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、PI3K（磷脂酰肌醇3 激酶）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路中部分靶點(diǎn)，主要集中在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、炎癥、神經(jīng)保護(hù)、血管生成及花生四烯酸代謝方面發(fā)揮治療腦缺血損傷作用。

3.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

分子對(duì)接技術(shù)可研究活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能力，有利于驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分和靶點(diǎn)。將PPI 網(wǎng)絡(luò)中前30 個(gè)靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)成分進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol，表明其結(jié)合性好[24]。分子對(duì)接結(jié)果顯示梔子苷、莪術(shù)二酮、新莪術(shù)二酮可能為醒腦靜治療腦缺血的關(guān)鍵活性成分，分別選取4 組親和力較強(qiáng)的靶點(diǎn)構(gòu)建分子對(duì)接的3D 及2D 模式圖（圖7）。分子對(duì)接結(jié)果（表5）表明，多數(shù)醒腦靜入腦成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合力。

圖4 KEGG、GO 富集可視化結(jié)果Fig.4 KEGG and GO enrichment visualization results

表4 KEGG 富集后的主要通路 (前10)Table 4 Main pathways after KEGG enrichment (Top 10)

續(xù)表4

圖5 醒腦靜入腦成分-腦缺血靶點(diǎn)-KEGG 通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Brain absorption components of Xingnaojing Injection-cerebral ischemic target-KEGG pathway network diagram

圖6 醒腦靜注射液治療腦缺血主要通路圖Fig.6 Mian pathway diagram of Xingnaojing Injection for treatment of cerebral ischemia

4 討論

圖7 部分分子對(duì)接結(jié)果Fig.7 Part of molecular docking results

表5 分子對(duì)接結(jié)果Table 5 Molecular docking results

本研究通過(guò)TCMSP 查詢醒腦靜成分，得知除了梔子中的環(huán)烯醚萜類成分外，其余成分TCMSP 預(yù)測(cè)得到的BBB≥0.56。對(duì)于腦部疾病的治療，血腦屏障是其一大障礙，良好的BBB 值為其治療腦部疾病提供了可能[25]。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研及GC-MS 鑒定得到13 種醒腦靜注射液入腦成分，郁金涉及成分6 種（特有4 種，共有2 種）；梔子涉及成分7 種（特有4 種，共有3 種）；冰片涉及成分3 種，均為共有成分；麝香涉及1 種特有成分。其中莪術(shù)二酮、新莪術(shù)二酮、麝香酮、梔子苷靶點(diǎn)頻次較高，據(jù)報(bào)道梔子苷可以下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（ matrix metalloprotein，MMP）、星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）表達(dá)從而保護(hù)腦缺血再灌注大鼠模型血腦屏障[26]；麝香酮可以抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而具有神經(jīng)保護(hù)的特性[27]。

本研究關(guān)于入腦成分龍腦、麝香酮、莪術(shù)二酮、梔子苷、桉油精、芳樟醇、檸檬烯、α-蒎烯、梔子苷、梔子苷酸、京尼平龍膽雙糖苷的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果與其他文獻(xiàn)報(bào)道高度一致。文獻(xiàn)中預(yù)測(cè)龍腦的靶點(diǎn)有雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、前列腺素G/H 合酶1（prostaglandin G/H synthase 1，PTGS1）、前列腺素G/H 合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶 3（endothelial nitric oxide synthase 3，eNOS3）、羥甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（HMG-CoA reductase inhibitors，HMGCR）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ （ peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（stromelysin-1，MMP3）等，研究中預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)有ESR1、PTGS1、PTGS2、NOS3、MAOB、GABRA1、DRD2 等，龍腦靶點(diǎn)參與多條抗炎通路，其中以花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代謝通路為主[28-29]。

文獻(xiàn)中預(yù)測(cè)到麝香酮的靶點(diǎn)有 AKT1、MAPK14、ADRB1、PTGS2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等[20]，研究中預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)有AKT1、MAPK14、ADRB1、PTGS2、ALOX5、NOS2 等；文獻(xiàn)中預(yù)測(cè)到莪術(shù)二酮的靶點(diǎn)有NOS3、PTGS2、PDE4B、ADRB1 等[30]，本研究預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)有 NOS3、PTGS2、PDE4B、HMOX1 等；文獻(xiàn)中預(yù)測(cè)到梔子中環(huán)烯迷萜類成分（梔子苷、梔子苷酸、京尼平龍膽雙糖苷）涉及靶點(diǎn)有BCL2、MMP12、HSP90AA1、NOS3、ALOX5等[31-32]，本研究預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)為BCL2、MMP12、HSP90AA1、HMOX1、F2 等。在本研究預(yù)測(cè)的入腦成分靶點(diǎn)中，龍腦、麝香酮、莪術(shù)二酮、桉油精均涉及靶點(diǎn)PTGS2，龍腦、莪術(shù)二酮、桉油精均涉及靶點(diǎn)NOS3，龍腦、芳樟醇、檸檬烯、蒎烯涉及靶點(diǎn)GABRA1 等，說(shuō)明這些入腦成分在治療腦缺血疾病時(shí)可能存在協(xié)同作用。本研究預(yù)測(cè)的是與腦缺血相關(guān)的靶點(diǎn)，其他文獻(xiàn)為不同疾病的靶點(diǎn)，如冠心病、哮喘等，因而存在差異。

醒腦靜注射液可能作用于93 個(gè)腦缺血靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)有潛在的協(xié)同治療作用，如COX-2、MAO等可介導(dǎo)腦缺血損傷的炎癥反應(yīng)，COX-2 作為花生四烯酸代謝產(chǎn)生前列腺素的主要限速酶，被稱為“炎癥反應(yīng)基團(tuán)”，參與合成前列腺素，調(diào)控有絲分裂、細(xì)胞生長(zhǎng)[33]；說(shuō)明醒腦靜可能通過(guò)降低COX-2活性減輕腦缺血損傷炎癥反應(yīng)從而改善腦缺血造成的腦組織損傷[34]。有研究表明單胺氧化酶可參與調(diào)控神經(jīng)方面的疾病[30]。AKT1、Bcl-2、eNOS 等調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，AKT1 又稱蛋白激酶B，對(duì)腦缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡起重要的調(diào)控作用[33]。磷酸化的eNOS 可抑制細(xì)胞凋亡，改善腦缺血損傷[10]。

絲裂原活化蛋白激酶家族（JNK、P38）在氧化應(yīng)激、DNA 損傷等條件下可被激活。說(shuō)明醒腦靜主要調(diào)節(jié)COX-2、MAO、AKT1、Bcl-2、eNOS、MAPKs等靶點(diǎn)參與炎癥、凋亡、血管、神經(jīng)等腦缺血相關(guān)環(huán)節(jié)。

根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果醒腦靜主要參與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路等，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路主要調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)生長(zhǎng)因子發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[35]；VEGF 能夠增加血管通透性，醒腦靜可能通過(guò)調(diào)節(jié)花生四烯酸通路及VEGF通路，抑制炎癥因子造成的腦缺血損傷[10]；IL-17 參與了血管生成、免疫調(diào)節(jié)等環(huán)節(jié)，拮抗IL-17可有效抑制ERK 通路的活化[36]；PI3K-Akt 信號(hào)通路是一條重要的抗細(xì)胞凋亡、促細(xì)胞增殖信號(hào)通路，多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可激活該通路發(fā)揮腦保護(hù)作用[37]；松弛素可舒張血管、促進(jìn)血管再生等來(lái)改善腦卒中患者的血管狀態(tài)[38]。綜上所述，醒腦靜可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路參與炎癥、血管、凋亡、神經(jīng)因子等的調(diào)節(jié)來(lái)達(dá)到治療腦缺血目的，充分體現(xiàn)中藥復(fù)方“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的特性。本研究?jī)H對(duì)醒腦靜治療腦缺血的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)，后期還需要通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其入腦成分治療腦缺血機(jī)制進(jìn)行深入驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突