基于代謝組學(xué)的苦碟子注射液抗心肌缺血作用機(jī)制研究

李 瑛，邵 鑫，李春燕，畢成浩，王 幸，王玉明，李 鈺，楊 彬*，李遇伯*

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617

2.通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司，吉林 通化 134100

隨著人口的老齡化，冠心病等心腦血管類疾病的發(fā)病率逐年增長，成為城鄉(xiāng)居民死亡的首要原因，嚴(yán)重威脅人們的健康。冠心病是由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等病變引起心肌缺血、缺氧或壞死所致，主要表現(xiàn)為心絞痛、心肌梗死等心肌缺血典型癥狀。心肌缺血是一種常見的心肌損傷，是由于心臟的血液灌注量減少，導(dǎo)致心臟的供氧減少，心肌能量代謝異常，不能支持心臟正常工作的病理狀態(tài)，可導(dǎo)致心臟功能障礙、心肌梗死、猝死等[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展雖在心肌缺血疾病的防治、診斷和治療方面取得了一定進(jìn)展，但仍未完全改變心肌缺血發(fā)病率和死亡率持續(xù)升高的現(xiàn)狀[2]。因此，抗心肌缺血藥物的研究仍然是醫(yī)學(xué)界備受關(guān)注的重要課題。

在臨床治療中，苦碟子注射液（Kudiezi Injection，KDZ）廣泛用于冠心病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病和心絞痛等心肌缺血類疾病的防治[3-4]。KDZ 是由抱莖苦荬菜經(jīng)水煎提取精制而成的中藥制劑，在擴(kuò)張心腦血管、增加血流量、保護(hù)心腦細(xì)胞、改善神經(jīng)功能缺損等方面作用較為突出[5-6]。其化學(xué)成分復(fù)雜，主要含黃酮類、倍半萜內(nèi)酯類、三萜皂苷類、有機(jī)酸、氨基酸和多糖等化合物。目前，關(guān)于KDZ 的研究主要集中在化學(xué)成分、質(zhì)量控制等方面，而KDZ 預(yù)防心肌缺血的藥效作用及其機(jī)制研究較少。因此，本研究通過代謝組學(xué)技術(shù)探究KDZ 對大鼠心臟保護(hù)作用的作用機(jī)制。

代謝組學(xué)通過研究早期潛在的代謝標(biāo)志物為生物系統(tǒng)提供完整、準(zhǔn)確、動(dòng)態(tài)的代謝網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)一步揭示生物體新陳代謝過程中代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，有助于全面理解疾病的變化過程和闡釋發(fā)病機(jī)制及體內(nèi)物質(zhì)代謝途徑等[7]。本研究采用異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）建立大鼠心肌缺血模型，通過生化檢測和病理組織切片研究，探究KDZ 對大鼠心臟的保護(hù)作用。采用UPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)，對大鼠心臟組織和血漿樣本進(jìn)行無靶向代謝組學(xué)研究，通過多元統(tǒng)計(jì)分析篩選生物標(biāo)志物，分析KDZ 對生物標(biāo)志物的調(diào)控作用及調(diào)控通路，以期為闡明KDZ 預(yù)防心肌缺血的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

XK96-A 快速混勻器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）；ALLLEGRATM-64R 高速離心機(jī)（美國Beckman 公司）；Waters Acquity UPLC 液相色譜儀、Waters Xevo G2 Q-Tof/MS 質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（美國Waters 公司）；分析天平 [賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；7020 全自動(dòng)生化儀（日本日立公司）；KQ-300DV 型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

乙腈（HPLC 純，瑞典Oceanpak 公司）；甲酸（HPLC 純，美國ROE 公司）；甲醇（HPLC 純，瑞典Oceanpak 公司）；異丙腎上腺素（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；美托洛爾（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；生理鹽水（大連大冢公司）；KDZ（批號(hào)181006，規(guī)格10 mL/支，通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司）；純凈水（廣州屈臣氏公司）。

1.3 動(dòng)物

潔凈級(jí)Wistar 雄性大鼠，體質(zhì)量為（200±20）g，由維通利華（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)為SCXK（京）2016-0006。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照飼養(yǎng)和使用指南進(jìn)行，并經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（ 批準(zhǔn)號(hào)TCM-2013-12-A06）。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，晝夜節(jié)律正常。

2 方法

2.1 動(dòng)物的分組與給藥

所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，每天給予標(biāo)準(zhǔn)的食物與飲用水。將大鼠隨機(jī)分為4 組，每組各15只。查閱文獻(xiàn)并結(jié)合臨床應(yīng)用劑量分別給藥[8-10]，給藥周期14 d，各組給藥劑量、方式及時(shí)間見表1。

表1 各組大鼠給藥劑量、方式及時(shí)間Table 1 Dosages,ways,and time of administration of each group of rats

2.2 樣本采集

各組大鼠于末次給予相應(yīng)藥物30 min 后，10%水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈取血，2 mL 置離心管中，3500 r/min 離心8 min 離心取上清，用于當(dāng)天生化指標(biāo)檢測；5 mL 置肝素鈉試管中，3500 r/min 離心8 min 取上清，用于后續(xù)代謝組學(xué)研究。腹主動(dòng)脈取血后，水合氯醛麻醉處死，剪下大鼠心臟，切下一部分放置于10%甲醛中保存用于病理組織評(píng)價(jià)，其余部分迅速放置于液氮中保存，用于后續(xù)代謝組學(xué)研究。樣本均保存于-80 ℃冰箱。

2.3 生化指標(biāo)檢測和組織學(xué)評(píng)價(jià)

利用全自動(dòng)生化儀測定血清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）含量，采用試劑盒檢測血漿和心臟組織中MDA（malondialdehyde，丙二醛）含量。

心臟組織進(jìn)行HE 染色，觀察藥物對各組大鼠心臟組織損傷的影響。HE 染色過程：脫水石蠟切片后，經(jīng)二甲苯脫蠟、水化、蘇木素染色10 min、分化、伊紅染色、脫水、二甲苯透明、中性樹脂膠封片制成片（4 μm 厚）[11]。然后在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心臟的病理表現(xiàn)，對主要部位進(jìn)行拍照，進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢查和組織學(xué)評(píng)價(jià)。

2.4 代謝組學(xué)研究

2.4.1 樣本制備

（1）血漿樣本制備：室溫解凍，取100 μL 血漿，加入300 μL 乙腈，冰水浴超聲10 min，渦旋混勻，以13 000 r/min、4 ℃離心15 min，取100 μL 上清進(jìn)樣分析。每個(gè)血漿樣本各取20 μL 于離心管中，渦旋混合，按照上述操作制備血漿質(zhì)控（quality control，QC）樣本。

（2）心臟組織樣本制備：室溫解凍，剪碎并混勻，每100 毫克加200 μL 預(yù)冷的生理鹽水勻漿。取100 μL，加入1000 μL 甲醇，渦旋混勻，冰水浴超聲10 min，以13 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，氮?dú)獯蹈桑R測時(shí)純甲醇復(fù)溶，渦旋，離心取上清進(jìn)樣分析。另外，每個(gè)心臟組織各取10 μL勻漿液于離心管中，渦旋混合，隨后按照上述操作制備心臟組織QC 樣本[12]。

2.4.2 UPLC-Q-TOF/MS 分析條件

（1）色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），體積流量為0.3 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量5 μL，流動(dòng)相為0.1%甲酸-水（A）和0.1%甲酸溶液-乙腈（B）。梯度洗脫條件：0～0.5 min，1% B；0.5～2 min，1%～50%B；2～9 min，50%～99% B；9～10 min，99% B；10～10.5 min，99%～1% B；10.5～12 min：1% B。

（2）質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（ESI 源），正離子模式，輔助噴霧電離與脫溶劑氣體為高純N2，干燥氣體積流量為10 mL/min，N2溫度350 ℃，霧化氣氣壓為310 kPa，脫溶劑氮?dú)怏w積流量為600 L/h，錐孔反吹氮?dú)怏w積流量為50 L/h，毛細(xì)管電離電壓為2.1 kV，掃描范圍：m/z50～1000。

2.4.3 方法學(xué)考察 分別用心臟組織和血漿QC樣本進(jìn)行方法學(xué)考察。取同一QC 樣本溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，隨機(jī)選擇20 個(gè)色譜峰，計(jì)算色譜峰峰面積和保留時(shí)間的RSD 值，進(jìn)行儀器精密度考察；平行配制6 份QC 樣本，連續(xù)分析，隨機(jī)選取20個(gè)色譜峰，計(jì)算峰面積和保留時(shí)間的RSD 值，進(jìn)行方法精密度考察；取同一QC 樣本溶液，分別在0、4、8、12、16 h 進(jìn)樣分析，隨機(jī)選取20 個(gè)色譜峰，計(jì)算峰面積和保留時(shí)間的RSD 值，進(jìn)行樣本穩(wěn)定性考察。

2.4.4 數(shù)據(jù)處理 將采集所得的 UPLC-QTOF/MS 原始數(shù)據(jù)經(jīng)過 MarkerLynx applications manager Version 4.1（美國Waters 公司）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)導(dǎo)出，對譜圖進(jìn)行峰發(fā)現(xiàn)、峰對齊、峰過濾等操作和數(shù)據(jù)修約，獲得代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，導(dǎo)入SIMCA-P12.0 統(tǒng)計(jì)軟件（瑞典Umetrics 公司）進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘辨別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，PLS-DA），篩選得到可變重要性（variable importance，VIP）＞1 的作為潛在生物標(biāo)志物。并使用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件（美國SPSS 公司）進(jìn)行t檢驗(yàn)，以VIP＞1 且P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異生物標(biāo)志物，對其進(jìn)行物質(zhì)鑒定，通過與對照品比對二級(jí)質(zhì)譜碎片，以及代謝物數(shù)據(jù)庫如HMDB（http://www.hmdb.ca/）、KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）匹配確定生物標(biāo)志物。此外，通過分層聚類分析觀察標(biāo)志物的變化趨勢，受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）對鑒定的生物標(biāo)志物進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證，同時(shí)判斷這些標(biāo)志物對心肌缺血是否有診斷意義。通過MetaboAnalyst 數(shù)據(jù)庫（https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml）進(jìn)行代謝通路分析[13]。

3 結(jié)果

3.1 生化分析

按照“2.3”項(xiàng)方法進(jìn)行生化分析，結(jié)果顯示，KDZ 和陽性藥對心肌缺血有相同的保護(hù)作用，KDZ可以減輕大鼠心肌缺血的癥狀。心肌受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加而導(dǎo)致心肌酶的大量外漏，以LDH 的變化最為顯著，其含量與損傷程度呈正比。另外，氧自由基與心肌缺血、缺氧損傷密切相關(guān)。心肌缺血后，MDA 大量蓄積，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，造成心肌細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷，故可判斷心肌損傷的程度。如圖1 所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中AST、LDH 及血漿和心臟組織中MDA水平顯著升高（P＜0.01），表明大鼠給予ISO 后對心肌造成明顯的損傷。與模型組相比，KDZ 組大鼠血清AST、LDH 及血漿MDA 水平顯著降低（P＜0.05、0.01）；陽性對照組血清LDH 及血漿和心臟組織MDA 水平顯著降低（P＜0.05、0.01），血清AST 水平具有下降趨勢。

3.2 病理組織觀察

病理組織學(xué)結(jié)果如圖2 所示，顯微鏡下可見，對照組大鼠心臟組織形態(tài)正常，心肌纖維排列正常，間質(zhì)無異常，未見炎癥反應(yīng)。模型組大鼠心臟組織形態(tài)損傷嚴(yán)重，心肌纖維水腫，胞質(zhì)疏松淡染（箭頭）面積較大，局部心肌纖維排列不規(guī)則（黑框），間質(zhì)疏松，炎癥癥狀明顯。KDZ 組和陽性對照藥組均可改善心肌缺血癥狀。

3.3 無靶向代謝組學(xué)研究結(jié)果

圖1 各組大鼠生化指標(biāo)的變化 (±s,n=6)Fig.1 Changes of biochemical indexes in rats of each group (±s,n=6)

圖2 HE 染色觀察各組大鼠心臟組織病理學(xué)變化 (×200)Fig.2 Pathological changes of heart of rats in each group observed by HE staining ( × 200)

3.3.1 方法學(xué)考察 分別采用心臟組織和血漿QC樣本進(jìn)行儀器精密度、方法精密度和樣本穩(wěn)定性考察，前期研究發(fā)現(xiàn)正離子模式下可檢測更多生物標(biāo)志物，大鼠心臟組織和血漿QC 樣本正離子模式基峰強(qiáng)度（base peak intensity，BPI）圖如圖3 所示。結(jié)果顯示心臟組織QC 樣本正離子模式色譜峰峰面積RSD＜3.0%，保留時(shí)間RSD＜1.0%；血漿QC 樣本正離子模式色譜峰峰面積RSD＜2.5%，保留時(shí)間RSD＜1.0%。方法學(xué)考察結(jié)果合格，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3.2 生物標(biāo)志物的篩選 首先采用PCA 無監(jiān)督模式識(shí)別法對心臟組織和血漿樣本間的差異進(jìn)行直觀分析。在PCA 模型中，模型組大鼠心臟組織和血漿樣本與對照組有一定的區(qū)分，為了使樣本達(dá)到最大化分離，建立有監(jiān)督模式識(shí)別的PLS-DA 模型，如圖4 所示。結(jié)果顯示，心臟組織R2X＝0.467，R2Y＝0.996，Q2＝0.824；血漿樣本R2X＝0.565，R2Y＝1.000，Q2＝0.990，兩組樣本都分布在不同區(qū)域，且各樣本點(diǎn)在一定區(qū)域聚集，表明2 個(gè)樣本的R2和Q2值較高，說明PLS-DA 模型沒有發(fā)生過擬合，模型可靠，有很好的預(yù)測能力。

圖3 QC 樣本正離子模式BPI 圖Fig.3 BPI diagram of positive ion mode of QC sample

圖4 大鼠心臟組織、血漿樣本的多元數(shù)據(jù)分析Fig.4 Multivariate data analysis of heart tissue and plasma in rat

根據(jù)VIP 值結(jié)合t檢驗(yàn)（P＜0.05），在HMDB（ http://www.hmdb.ca/ ） 數(shù) 據(jù) 庫、 Chemspider（http://www.chemspider.com/）數(shù)據(jù)庫中，利用m/z值尋找生物標(biāo)志物，并通過二級(jí)碎片比對分析、代謝物數(shù)據(jù)庫信息及文獻(xiàn)信息確認(rèn)潛在生物標(biāo)志物。結(jié)果在心臟組織中篩選出生物標(biāo)志物11 個(gè)，血漿樣本中篩選出10 個(gè)生物標(biāo)志物（表2）。

3.3.3 分層聚類分析 為了更形象化地分析心肌缺血診斷生物標(biāo)志物的變化，采用分層聚類分析法，對以上發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物進(jìn)行分析，觀察標(biāo)志物的變化趨勢。分層聚類分析得到的熱圖見圖5。圖中水平軸和垂直軸分別代表樣本與生物標(biāo)志物，顏色深淺反映變量值大小，棕色表示含量最高，藍(lán)色表示含量最低，垂直軸中的分叉越近說明相似度越高。從圖5 可以看出，在心臟組織和血漿樣本中，對照組和模型組的生物標(biāo)志物有明顯的區(qū)別，且能完全分開，驗(yàn)證了這些生物標(biāo)志物的判別能力。

3.3.4 ROC 曲線分析 利用ROC 曲線評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物的診斷準(zhǔn)確性。如圖6 所示，心臟組織和血漿樣本的每個(gè)的標(biāo)志物的曲線下面積（area under curve，AUC）均大于0.7，表明其對診斷心肌缺血具有較好的準(zhǔn)確性，篩選的生物標(biāo)志物具有診斷能力。

3.3.5 KDZ 對心臟組織和血漿中生物標(biāo)志物的影響 KDZ 可以顯著回調(diào)心臟組織中PC（18∶1/18∶1）的水平，顯著調(diào)節(jié)血漿中LysoPC（20∶3）、肉豆蔻酸、硬脂酰肉堿、L-棕櫚酰肉堿、植物鞘氨醇、LysoPC（22∶6）的水平。KDZ 對心臟組織和血漿中生物標(biāo)志物的影響變化見表2。

3.4 代謝通路分析

將篩選到的生物標(biāo)志物輸入MetaboAnalyst 中進(jìn)行通路分析，結(jié)果如圖7 所示，主要涉及亞麻酸代謝、谷胱甘肽代謝、甘油磷脂代謝、鞘脂代謝和甾類激素生物合成等代謝通路。甘油磷脂代謝和谷胱甘肽代謝則與氧化應(yīng)激關(guān)系密切，研究結(jié)果提示心肌缺血可能影響上述途徑，使整個(gè)狀態(tài)失調(diào)KDZ通過調(diào)控以上通路對心肌缺血起到預(yù)防作用。

表2 心臟組織和血漿中生物標(biāo)志物具體信息Table 2 Specific information of biomarkers in heart tissue and plasma

圖5 心臟組織和血漿樣本生物標(biāo)志物聚類分析Fig.5 Cluster analysis of biomarkers in heart tissue and plasma samples

圖6 心臟組織和血漿樣本生物標(biāo)志物ROC 曲線分析Fig.6 ROC curve analysis in heart tissue and plasma samples

4 討論

圖7 生物標(biāo)志物相關(guān)代謝通路富集分析Fig.7 Enrichment analysis of biomarker-related metabolic pathways

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，KDZ 對大鼠心肌損傷有一定保護(hù)作用，作用機(jī)制可能與改善缺血心肌的能量代謝、穩(wěn)定細(xì)胞膜、清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)，其可明顯增加心肌血流量，降低冠脈血管阻力，改善微循環(huán)[8,14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，ISO 造成大鼠心肌缺血代謝紊亂，KDZ 可以有效保護(hù)大鼠心臟組織，血漿和心臟組織中均涉及甘油磷脂代謝通路，除此之外，血漿中還涉及鞘脂代謝和谷胱甘肽代謝通路，心臟組織還涉及亞麻酸代謝和甾類激素生物合成通路。

4.1 谷胱甘肽代謝

氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過度的活性氧或抗氧化防御功能減弱，破壞氧化與抗氧化平衡，從而導(dǎo)致組織或細(xì)胞損傷的一種狀態(tài)[16]。有一些內(nèi)在的抗氧化系統(tǒng)可以阻止細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累。谷胱甘肽在維持細(xì)胞正常生理活動(dòng)中起重要作用，是人體重要的生物活性物質(zhì)、抗氧化劑和還原緩沖劑，可對氧化還原系統(tǒng)發(fā)揮活化作用，激活巰基酶，從而有效清除自由基和其他活性氧（如羥基自由基、脂質(zhì)過氧自由基、過氧亞硝酸鹽、H2O2），促進(jìn)碳水化合物代謝、脂肪代謝以及蛋白質(zhì)代謝，進(jìn)而有效調(diào)節(jié)細(xì)胞膜代謝[17-19]。本研究中，模型組心臟組織內(nèi)谷胱甘肽水平明顯下降，KDZ 可使谷胱甘肽水平升高，表明KDZ 可以降低心臟組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

4.2 甘油磷脂代謝

溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）類物質(zhì)是一類磷脂類物質(zhì)，是生物膜的重要組成部分。LPC 主要由組織中磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）家族的酶和血漿中糖蛋白卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（lecithin cholesterol acetyltransferase，LCAT）催化[20]。在疾病發(fā)展過程中，蛋白質(zhì)激酶C（protein kinase C，PKC）途徑被激活，PLA2 活性增加，因此血漿溶血性磷脂酰膽堿LysoPC（20∶3）、LysoPC（18∶2）、LysoPC（18∶1 ） 的含量顯著降低。 磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）經(jīng)PLA2 水解產(chǎn)生LPC，在炎癥過程中起重要作用[21-22]。有報(bào)道顯示，LPC類物質(zhì)含量的變化與機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)激活相關(guān)，因此LPC 與包括心肌缺血在內(nèi)的許多疾病有密切聯(lián)系[23-25]。當(dāng)給予大鼠ISO 時(shí)，心臟受到損傷，激活了體內(nèi)活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）的生成，致使體內(nèi)氧化應(yīng)激水平發(fā)生變化，機(jī)體氧化和抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的損傷[26-27]。增加的LysoPC 可能誘發(fā)心肌缺血中的炎癥，細(xì)胞凋亡和心臟收縮功能障礙[28]。據(jù)報(bào)道，LysoPE 被認(rèn)為是重要的致心律失常脂質(zhì)，在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎所致的心肌梗死大鼠的梗死心肌中會(huì)增加。本研究表明，與對照組相比，模型組大鼠的心臟組織中LysoPE（16∶1）、LysoPE（16∶0）含量顯著增加，KDZ 可維持LysoPC、PC和LysoPE 的正常水平；模型組大鼠的血漿PC（22∶4/16∶0）、LysoPC（22∶6）的含量明顯增加，而KDZ 可維持LysoPC、PC 和LysoPE 的正常水平，表明KDZ 可維持心肌缺血期間甘油磷脂代謝紊亂的穩(wěn)定性。

4.3 亞麻酸代謝

α-亞麻酸是一種具有抗氧化活性的不飽和脂肪酸，可降低血脂和纖維蛋白原含量，抑制血栓和動(dòng)脈粥樣硬化的形成，從而保護(hù)心血管，預(yù)防心肌梗死的發(fā)生[29]。當(dāng)心肌損傷缺血、缺氧后，引發(fā)心肌動(dòng)脈壁內(nèi)層微小損傷，血壓升高，導(dǎo)致心臟內(nèi)α-亞麻酸的含量下降。提前給予KDZ 的大鼠心臟組織中α-亞麻酸的含量較模型組水平升高，表明KDZ可通過回調(diào)α-亞麻酸的水平抗心肌損傷。

4.4 其他

KDZ 在治療冠心病心絞痛中得到了廣泛的應(yīng)用，其主要機(jī)制為擴(kuò)張血管，增加血流量，降低氧代謝，提高缺氧耐受性，有效抑制血小板聚集，進(jìn)而改善微循環(huán)，使得纖維蛋白溶解酶的活性增加，清除自由基。KDZ 主要成分包括黃酮類、有機(jī)酸類、倍半萜類等。黃酮類化合物具有保護(hù)心肌缺血損傷、提高機(jī)體清除自由基能力的作用，可有效擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和血管，抑制血栓形成，使心肌平滑肌的收縮舒張能力得到改善，對鐵具有螯合作用，抑制蛋白激酶以及鈣拮抗。KDZ 的自由基清除作用可能與其含有腺苷和異黃酮有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，異黃酮可提高機(jī)體抗氧化酶的活性，通過清除自由基而發(fā)揮保護(hù)作用。木犀草素及腺苷具有較強(qiáng)的抗氧化活性，有關(guān)藥理活性及臨床試驗(yàn)表明其在體內(nèi)有調(diào)節(jié)血脂、降低膽固醇、抗菌以及抗病毒的作用。而有機(jī)酸類物質(zhì)能夠抑制血小板的聚集黏連，誘導(dǎo)血管舒張，并抑制脂新陳代謝中的酶作用，有助于防止冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化和卒中等常見心腦血管疾病的發(fā)生[30]。

鞘脂是真核細(xì)胞膜的重要組成部分，鞘脂類作為生物膜的重要結(jié)構(gòu)成分，在信號(hào)傳輸中起重要作用[31]。鞘氨醇水平高會(huì)降低缺血/再灌注過程中的心臟收縮力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。植物鞘氨醇可通過激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和釋放細(xì)胞色素來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究顯示，與對照組相比，模型組大鼠血漿中的鞘氨醇、植物鞘氨醇水平升高，造成心臟血流動(dòng)力學(xué)異常，從而造成心肌的損傷；而KDZ 中樞神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)處理降低了大鼠血漿鞘氨醇和植物鞘氨醇的水平。皮質(zhì)酮與心肌纖維化有關(guān)系。心肌缺血大鼠體內(nèi)皮質(zhì)酮水平下降，KDZ 組皮質(zhì)酮水平回調(diào)，表明KDZ 可通過回調(diào)皮質(zhì)酮水平預(yù)防心肌缺血。肉堿類物質(zhì)是判斷能量代謝是否異常的可靠生物標(biāo)志物，是參與脂肪酸代謝和三羧酸循環(huán)反應(yīng)產(chǎn)生能量的重要成分[32]。肉堿不僅與體內(nèi)氧化反應(yīng)密切相關(guān)，也與心肌細(xì)胞的凋亡及能量代謝有聯(lián)系。

綜上，本研究通過ISO 建立大鼠心肌缺血模型探究KDZ 對心肌缺血損傷大鼠的心臟保護(hù)作用，采用UPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)和代謝組學(xué)分析，探討了心肌缺血的可能發(fā)病機(jī)制以及KDZ 預(yù)防心肌缺血的潛在作用機(jī)制。通過多元統(tǒng)計(jì)分析分別篩選得到11 個(gè)心臟標(biāo)志物和10 個(gè)血漿標(biāo)志物，其主要調(diào)控亞麻酸代謝、谷胱甘肽代謝、甘油磷脂代謝、甾類激素生物合成、鞘脂代謝等代謝通路。本研究為闡明KDZ 預(yù)防心肌缺血的作用機(jī)制提供依據(jù)，同時(shí)為KDZ 的臨床合理應(yīng)用提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突