基于網絡藥理學研究小兒升麻方對流感病毒性肺炎小鼠的治療作用機制

劉志東，陳金鵬,，周稼榮，周思雨，劉 毅,，劉素香,，任 濤,，田成旺,*，陳常青,*

1.天津中醫藥大學，天津 300193

2.天津藥物研究院，天津 300301

3.天津市中藥質量標志物重點實驗室，天津 300301

4.釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室，天津 300301

流感病毒性肺炎是由流感病毒性上呼吸道感染向下蔓延所致，流感并發的肺炎可分為原發性流感病毒性肺炎、繼發性細菌性肺炎和混合性肺炎[1-2]。流感病毒性肺炎多發于老人、兒童等免疫力低下者，早期表現流感癥狀，病情進展迅速，病死率較高[3]。由于流感病毒的抗原變異能力極強，臨床上主要以對癥治療為主，抗病毒等其他治療手段為輔[4]。中醫藥對流感病毒性肺炎有較好的治療作用[5]。小兒升麻方源自孫思邈的《備急千金要方》，由升麻、射干、生姜、陳皮4 味藥組成，為治療熱毒、咽塞的經典方藥[6]。本研究通過體內實驗探究小兒升麻方對流感病毒性肺炎小鼠的治療作用，并采用網絡藥理學方法探究小兒升麻方治療流感病毒性肺炎的作用機制，為其臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 網絡藥理學研究材料

中醫藥整合藥理學網絡計算研究平臺（ TCMIP ， http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/home/login/login.html）；Genecard 數據庫（https://www.genecards.org/）；STRING 數據庫（https://stringdb.org/cgi/input.pl）；OmicsBean 數據庫（http://www.omicsbean.cn/）；Venny 2.1.0 在線軟件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；Cytoscape 3.7.0 軟件。

1.2 動物

普通級昆明小鼠190 只，雌雄各半，體質量18～20 g，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供，合格證號0042219。動物在18～22 ℃，40%～60%濕度的環境中適應性飼養1 周。動物實驗遵循天津中醫藥大學實驗動物管理規定，符合3R 原則。

1.3 病毒

FM1 流感病毒株，由安徽省醫學科學研究所引進。實驗前經雞胚接種，收集48 h 尿囊液，測定血凝效價（1∶1024），于-70 ℃保存備用。

1.4 藥品

小兒升麻方浸膏（每克含生藥6.302 g）由天津藥物研究院提供，實驗前將浸膏配制成質量濃度為1.89 g/mL（以生藥量計）的母液。

2 方法

2.1 小兒升麻方對流感病毒性肺炎小鼠的影響

2.1.1 測定小兒升麻方的最大給藥量 取小鼠10只，雌雄各半，禁食12 h 后ig 0.5 mL 小兒升麻方母液（47.25 g/kg）。觀察7 d，如無死亡，計算小鼠的最大給藥量倍數。

最大給藥量倍數＝250×小鼠耐受量/成人每日用量

2.1.2 測定FM1 流感病毒尿囊液的半數致死量（lethal dose，LD50） 取小鼠60 只，雌雄各半，隨機分為6 個不同稀釋倍數（1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6）病毒組，每組10只。小鼠在乙醚麻醉下，經鼻滴入0.03 mL FM1 流感病毒尿囊液，觀察小鼠死亡情況，第14 天按Reed-Muench 法計算LD50。

2.1.3 分組與給藥 根據前期預實驗，取小鼠60 只，雌雄各半，隨機分為對照組，模型組，小兒升麻方低、中、高劑量（1.75、3.50、7.00 g/kg）組，生理鹽水組，每組10 只。將小兒升麻方母液稀釋成質量濃度為0.175、0.350、0.700 g/mL 的溶液，分別用作小兒升麻方低、中、高劑量組給藥。除對照組和模型組外，各給藥組ig 相應藥物（10 μL/g），生理鹽水組ig 等體積生理鹽水，1 次/d，連續6 d。于給藥第2 天，除對照組外，其余各組小鼠經鼻滴入0.03 mL FM1 流感病毒尿囊液（尿囊液稀釋5244 倍，病毒感染量為15 LD50）。給藥結束后，小鼠禁食禁水24 h，稱定質量，脫頸椎處死，取出肺組織，測定肺指數。

肺指數＝小鼠肺質量/體質量

2.2 網絡藥理學研究

在TCMIP 數據庫[7]中查找小兒升麻方各藥材成分和靶點信息，在Genecards 數據庫[8]以“流感病毒性肺炎”為關鍵詞搜索相關靶點，通過Venny 2.1.0 在線軟件[9]與小兒升麻方化學成分的靶點映射篩選出共同靶點作為研究靶點。借助OmicsBean 分析平臺[10]與STRING 數據庫[11]對共同靶點進行基因本體（gene ontology，GO）生物過程分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析。將共同靶點導入STRING 數據庫中構建蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，利用Cytoscape 3.7.0 軟件進行可視化處理，篩選出核心靶點，構建“藥材-成分-靶點-通路”網絡。

3 結果

3.1 體內抗流感病毒性肺炎實驗

3.1.1 小兒升麻方最大給藥量的確定 小鼠ig 小兒升麻方（47.25 g/kg）7 d 內未出現死亡，小兒升麻方的給藥劑量相當于人臨床用量的112.49 倍，表明其安全范圍較大、毒性較小。

3.1.2 FM1 流感病毒尿囊液對小鼠的LD50FM1流感病毒尿囊液對小鼠的LD50為4.895，即尿囊液稀釋78 660 倍時能使50%小鼠死亡。

3.1.3 小兒升麻方對流感病毒性肺炎小鼠肺指數的影響 如表1 所示，與模型組比較，小兒升麻方高劑量組可明顯降低流感病毒性肺炎小鼠肺指數（P＜0.05），表明7.00 g/kg 小兒升麻方對流感病毒性肺炎小鼠有一定治療作用。

表1 小兒升麻方對流感病毒性肺炎小鼠肺指數的影響Table 1 Effect of Xiaoer Shengma Formula on lung index of mice with influenza virus pneumonia

3.2 網絡藥理學研究

3.2.1 小兒升麻方中藥材、成分和靶點的預測 通過借助TCMIP 數據庫，篩選出小兒升麻方化學成分217 個，其中陳皮化學成分44 個、升麻化學成分24 個、射干化學成分25 個、生姜化學成分124個。小兒升麻方的候選靶點共有1098 個。

3.2.2 流感病毒相關靶點的篩選 通過Genecards數據庫共搜集到流感病毒性肺炎相關靶點1308 個，與小兒升麻方1098 個候選靶點在Venny 2.1.0 中映射篩選出69 個共同靶點。

3.2.3 共同靶點的GO 分析和KEGG 信號通路富集分析 利用OmicsBean 分析平臺對共同靶點進行GO 分析，P＜0.5 前10 條如圖1 所示，生物過程主要涉及細胞活化（B 細胞和T 細胞的分化）、細胞對化學刺激的反應、生物過程的負調控等過程；細胞組分主要涉及細胞外泌體、細胞外小泡、細胞外細胞器等過程；分子功能主要涉及RNA 結合、蛋白質結合、雜環化合物結合等過程。

將69 個共同靶點輸入到STRING 數據庫中，得到88 條通路（錯誤發生率＜0.01），對其進行KEGG 分析并查閱相關文獻，通過OmicsBean 分析平臺對錯誤發生率排名前10 的通路進行可視化處理，如圖2 所示，主要有麻疹、結核、軍團菌病、百日咳、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、人巨細胞病毒感染、弓形蟲病、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、致病性大腸桿菌感染等通路。

圖1 共同靶點的GO 富集分析Fig.1 GO enrichment analysis of common targets

圖2 共同靶點KEGG 通路富集分析的前10 條通路Fig.2 Top 10 pathways for enrichment analysis of common target KEGG pathway

圖3 共同靶點的PPI 網絡Fig.3 PPI network of common targets

3.2.4 小兒升麻方靶點PPI分析 將69個共同靶點蛋白輸入STRING 數據庫，構建PPI 網絡。該網絡共有68 個節點，483 條相互作用關系，平均度值為14.2。將PPI 網絡數據導入Cytoscape 3.7.0 中，度值降序排列篩選出大于平均度值的核心靶點24 個，如圖3 所示，包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine-threonine kinase 1，AKT1）、白蛋白（albumin，ALB)、熱休克蛋白90α（heat shock protein 90α，HSP90AA1）、β-肌動蛋白（β-actin，ACTB）、雌激素受體（estrogen receptor，ESR1）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、TNF、熱休克蛋白8（heat shock protein 8，HSPA8）、α-烯醇酶（α-enolase，ENO1）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，CASP3）、前列腺素內過氧化物酶2（prostaglandinendoperoxide synthase 2，PTGS2）、細胞色素C（ cytochrome C ， CYCS ）、 白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL1-β）、延伸因子1-α1（elongation factor 1-α1，EEF1A1）等。

為了進一步了解PPI 網絡的生物作用，使用Cytoscape 3.7.0 軟件對網絡進行Cluster 模塊分析，共獲得4 個Cluster 模塊，對4 個模塊進行富集分析，如圖4 所示，Cluster 1 主要與氮化合物代謝過程的正負調控、細胞凋亡過程、化學反應、代謝過程的負調控等生物過程有關；Cluster 2 主要與谷胱甘肽代謝、癌癥中的中央碳代謝、脂肪細胞因子信號通路、IgG Fc 受體（Fc γ receptors，FcγR）介導的吞噬作用等通路過程相關；Cluster 3主要與病毒的轉錄、翻譯有關；Cluster 4 主要與調控細胞生長、DNA 合成、mRNA 轉運等生物過程有關。

圖4 共同靶點Cluster 模塊的PPI 網絡Fig.4 PPI network of common target Cluster module

圖5 小兒升麻方“藥材-成分-靶點-通路”網絡Fig.5 “Herbs-compound-target-pathway” network of Xiaoer Shengma Formula

3.2.5 小兒升麻方“藥材-成分-靶點-通路”網絡構建 小兒升麻方“藥材-成分-靶點-通路”如圖5 所示，該網絡有20 306 條邊，且構建網絡的節點度分布服從冪分布[P(χ)＝30.660χ-0.947（r2＝0.714）]，表明小兒升麻方網絡為無標度網絡。特征路徑長度2.746，即網絡路徑長度為3 步，大多數靶點的聯系密切，表明該網絡具有較快的傳播速度和較小的反應時間，具有小世界性質。網絡異質性為1.500，平均相鄰節點數目6.467，網絡中心度0.411，提示小兒升麻方“藥材-成分-靶點-通路”網絡具有無標度、小范圍的結構體系。網絡中既存在一個分子與多個靶點的相互作用，也存在不同分子作用于同一個靶點的現象，顯示了小兒升麻方多成分、多靶點、多通路的作用特點，初步闡釋了小兒升麻方清熱解毒的藥效物質基礎和作用機制。

4 討論

中醫對病毒性肺炎有著豐富的診治經驗[12]，隨著中醫學和現代醫學的交流與相互滲透，中醫在流感病毒性肺炎的早期干預、恢復期調理和預后改善均具有明顯優勢[13]。中醫認為病毒性肺炎的病因為外感“疫戾”之氣，病位由表及里，多遵從上、中、下三焦和衛氣營血傳變規律。疫癘之氣容易兼夾濕熱，侵襲肺衛，尤其是素體脾胃虛弱者；若正不勝邪，邪毒入里化熱，傷津耗液，甚者灼營動血，直傳心包，發為危候。小兒升麻方中生姜、陳皮性溫可散寒，升麻、射干性寒可解郁熱。小兒升麻方以疏風寒、清內熱、祛燥濕、助化痰、解熱毒為主要治法，在疏風解表的基礎上，兼顧扶助正氣、清熱、理氣化痰，治療流感病毒性肺炎。

本研究考察了小兒升麻方對流感病毒性肺炎小鼠的治療作用，并采用網絡藥理學方法[14-16]探討小兒升麻方抗流感病毒性肺炎的作用機制。PPI 網絡分析表明，GAPDH、AKT1、ALB、HSP90AA1、ACTB、ESR1、IL-6、TNF、HSPA8、ENO1、CASP3、PTGS2、CYCS、IL1B、EEF1A1 等炎癥相關蛋白均具有較高的度值，處于網絡的中心位置，可能是小兒升麻方發揮抗流感病毒性肺炎作用的關鍵靶點。其中，AKT1 可被多種上游細胞因子如血管內皮生長因子等激活，在細胞增殖、存活和凋亡中發揮著重要作用；TNF-α 和IL-6 是重要的促炎因子，參與機體免疫應答和炎癥反應等多種病理過程。基于“藥材-成分-核心靶點-通路”網絡研究發現，升麻中的升麻醇（cimigenol）[17]、升麻素苷（cimicifugoside）、26-脫氧升麻苷（7,8-didehydro-27-deoxyactein），射干中的射干醛（belamcandal）[18]、28-去乙酰基射干醛（28-deacetylbelamcandal）[19]、野鳶尾黃素（irigenin）、鳶尾黃酮甲素（iristectorigenin A）、鳶尾苷元（tectorigenin）、5,6,7,4′-四羥基-8-甲氧基異黃酮（5,6,7,4′-tetrahydroxy-8-methoxyisoflavone）、5,6,7,3′-四羥基-4′-甲氧基異黃酮 （ 5,6,7,3′-tetrahydroxy-4′-methoxyisoflavone），陳皮中的β-谷甾醇（β-sitosterol），生姜中的龍腦（borneol）等成分，可能通過作用于CYCS、CASP3、HSP90AA1、EEF1A1、膜聯蛋白A2（annexin A2，ANXA2）、PTGS2、HSPA8、ESR1、IL-6、ACTB、TNF、核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NFKB1）、GAPDH、糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，NR3C1）、ENO1、熱休克蛋白β1（heat shock protein β1，HSPB1）、IL-1β 等關鍵靶點，影響C 型凝集素受體[20]、IL-17[21]、TNF[22]、人巨細胞病毒感染[23]等通路發揮抗炎和免疫調節的作用[24]。研究表明，流感病毒侵入呼吸道上皮細胞后被吞噬，感染細胞識別病毒RNA，激活細胞及體液免疫應答，產生“細胞因子風暴”，導致大范圍的組織損傷、全身炎癥反應綜合征[25-27]。因此，在抗病毒基礎上聯合免疫調節治療已成為研究焦點。

綜上所述，本研究通過體內抗病毒實驗發現小兒升麻方對流感病毒性肺炎有潛在的治療作用，并采用網絡藥理學方法揭示了其抗流感病毒性肺炎的藥效物質基礎、關鍵靶點及作用通路，發現小兒升麻方可能通過升麻醇、射干醛、野鳶尾黃素、鳶尾黃酮甲素等化學成分，作用于AKT1、TNF、IL-6、ESR1、NR3C1 等關鍵靶點，調節炎癥反應、凋亡、氧化應激等生物學過程，發揮抗流感病毒性肺炎作用，為小兒升麻方的臨床應用提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突