基于網絡藥理學探索青鹽方治療圍絕經期綜合征的配伍合理性研究

楊一博，徐 穎，王 璐，樊媛芳，林 娜

中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700

圍絕經期綜合征是指婦女因卵巢功能衰竭而出現的一系列由雌激素水平下降引起的不適癥狀，如心悸失眠、血壓升高、月經紊亂、煩躁易怒、失眠、骨質疏松等，中醫稱之為“絕經前后諸癥”，經典補腎方劑在臨床上具有良好的治療效果[1]。青鹽方源于宋代《圣濟總錄》，由肉蓯蓉、巴戟天、牛膝、蜀椒、青鹽組成，5 味藥皆入腎經，是補腎益精的經典方劑。肉蓯蓉甘咸而溫，質地滋膩，性柔而不燥，補腎壯陽之中還兼有強陰潤燥、益精之功，為君藥；巴戟天辛甘而溫，性偏燥而不柔，溫陽助火力勝，兼有祛風除濕之力，為臣藥；佐以牛膝、蜀椒（花椒），牛膝活血脈、補肝腎，既補且行能引藥入腎經，花椒溫補脾陽；青鹽為使藥，能引諸藥入腎經，潤燥潛降；諸藥通過調補腎氣陰陽、潤燥益精，以達防治絕經前后諸癥之功。課題組前期研究表明，青鹽方70%乙醇提取物具有雌激素樣作用，可促進未成熟小鼠生殖靶器官子宮、陰道的生長發育；還可抑制去雙側卵巢大鼠生殖靶器官萎縮，緩解實驗性圍絕經期綜合征近期焦慮癥狀和遠期骨質疏松癥狀[2-5]。但對于青鹽方治療圍絕經期綜合征的組方配伍規律及合理性研究尚不全面。本研究結合青鹽方君臣佐使組方特點，采用網絡藥理學方法，選取各組藥中的代表性成分進行分析，對該方的配伍合理性進行初步探究和闡釋。

1 材料

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數據庫（http://tcmspw.com/）、PubChem 數據庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、UniProt 數據庫（http://www.uniprot.org/）、Genecards數據庫（https://www.genecards.org/）、OMIM數據庫（https://omim.org/）、DisGeNET 數據庫（http://www.disgenet.org/）、STRING 數據庫（http://string-db.org/）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數據庫（http://www.genome.jp/kegg/）、Cytoscape 3.7.1 軟件、Rx64 3.6.1 軟件、DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）數據庫。

2 方法

2.1 藥物分組

根據中醫方劑君、臣、佐、使的配伍法則及青鹽方方解，對青鹽方進行以下拆方分組：君藥（肉蓯蓉）組、君＋臣藥（肉蓯蓉＋巴戟天）組、君＋臣＋佐藥（肉蓯蓉＋巴戟天＋花椒＋牛膝）組、君＋臣＋佐＋使藥（肉蓯蓉＋巴戟天＋花椒＋牛膝＋青鹽）組。

2.2 青鹽方各拆方組合的化學成分收集與篩選

在TCMSP 數據庫中以各中藥名稱檢索青鹽方5 味藥中所含的化學成分，篩選條件為生物利用度＞30%、類藥性＞0.18。結合文獻，不滿足篩選條件但文獻報道明確的有效成分也納入候選成分。

2.3 青鹽方各拆方組合的化學成分潛在作用靶點收集

在TCMSP 數據庫中以各中藥名稱進行檢索得到潛在藥物靶點。將潛在藥物靶點導入UniProt 蛋白數據庫，轉換為官方名稱，在PubChem 數據庫搜索青鹽主要成分NaCl 所對應的靶點，得到各拆方組合的化學成分相關候選靶點。

2.4 圍絕經期綜合征疾病的靶點預測

在Genecards數據庫、OMIM數據庫、DisGeNET數據庫查詢圍絕經期綜合征、雌激素低下、圍絕經期焦慮、生殖道萎縮、骨質疏松所對應的靶點信息作為疾病靶點信息。

2.5 各拆方組合作用于疾病和各病理時期的靶點預測

采用Rx64 3.7.1 軟件統計青鹽方各拆方組合與圍絕經期綜合征疾病和各病理時期的共同靶點，即為作用于圍絕經期綜合征疾病和各病理時期的作用靶點；將得到的作用于圍絕經期綜合征的靶點導入STRING 平臺獲得蛋白質-蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網絡，采用Cytoscape 軟件對PPI 網絡中的靶點進行拓撲屬性分析，篩選出點度中心性和介數中心性均超過平均值的靶點，作為后續分析的關鍵作用靶點[6]。

2.6 基因本體（geneontology，GO）、通路富集分析和網絡構建

通過Cytoscape 軟件對篩選得到的關鍵作用靶點進行GO 富集分析，在結果中選取P＜0.05，排名前10 的項目進行分析[7]。將關鍵作用靶點輸入DAVID 數據庫，利用KEGG 數據庫，選取P值（P＜0.05）排名前20 的通路進行分析。結合藥物化學成分、作用靶點、GO 富集分析和KEGG 富集分析結果，利用Cytoscape 軟件制作各拆方組合作用特點網絡分析圖[8]。

2.7 成分和機制的文獻驗證

通過檢索國內外文獻，挖掘分析青鹽方相關的活性成分治療圍絕經期綜合征的相關機制，為網絡藥理學所預測的結果提供文獻驗證。

3 結果

3.1 君藥作用特點分析

如表1所示，共得到君藥肉蓯蓉18個化學成分、240 個靶點。與疾病靶點作交集，得到216 個共有靶點，具體成分及靶點見表2。216 個共有靶點中，204 個與雌激素低下相關、33 個與圍絕經期焦慮相關、130 個與生殖道萎縮相關、139 個與骨質疏松有關，共214 個靶點參與了PPI 網絡。

對PPI 網絡進行拓撲屬性分析，點度中心性和介數中心性均超過平均值的關鍵作用靶點有40 個，分別為C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、谷胱甘肽S轉移酶P1（glutathioneS-transferase P1，GSTP1）、Myc 原癌基因蛋白（myc proto-oncogene protein，MYC）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、內皮型一氧化氮合酶 3（endothelial nitric oxide synthase 3，NOS3）、轉錄因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、雌激素受體α（estrogen receptor α，ESR1）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）、纖維連接蛋白（fibronectin，FN1）、受體酪氨酸蛋白激酶erbB-2（receptor tyrosine-protein kinase erbB-2，ERBB2）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、胰島素（insulin，INS）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、銅鋅超氧化物歧化酶1（Cu/Zn superoxide dismutase 1，SOD1 ）、 細胞周期蛋白 B1（G2/mitotic-specific cyclin B1，CCNB1）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、半胱氨酸蛋白酶8（caspase-8，CASP8）、小凹蛋白1（caveolin-1，CAV1）、RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、骨橋蛋白（osteopontin，SPP1）、G1/特異性細胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin D1，CCND1）、細胞色素P450酶家族3A4 亞型（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）、趨化因子8（C-X-C motif ligand 8，CXCL8）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、蛋白激酶Cα（protein kinase C alpha，PRKCA）、信號傳導及轉錄激活因子 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、間隙連接蛋白α-1（gap junction alpha-1 protein，GJA1）、轉錄因子p65（transcription factor p65，RELA）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）、過氧化物酶體增殖激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、絲氨酸蛋白激酶（serine-protein kinase ATM，ATM）、前列腺素 G/H 合成酶 2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、原癌基因c-Fos（proto-oncogene c-Fos，FOS），如圖1 所示。對關鍵作用靶點進行GO 富集分析，君藥組治療圍絕經期綜合征的相關生物過程涉及化學刺激反應、應激反應、生物過程的正負調控、組織發育、細胞過程的負調控、調控細胞增殖、對類固醇激素刺激的反應、細胞凋亡的調節等。排除廣泛通路，KEGG通路富集分析結果顯示其相關通路主要富集在ER信號通路（涉及9 個靶點）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路（涉及17 個靶點）、MAPK 信號通路（涉及15 個靶點）、缺氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信號通路（涉及14 個靶點）等。

表1 青鹽方“中藥-化學成分-預測靶點”信息Table 1 Information of “Chinese medicine-active ingredient-predictive target” for Qingyan Formula

表2 青鹽方作用于圍絕經期綜合征的化學成分及靶點信息Table 2 Components and targets information of Qingyan Formula

3.2 君＋臣藥組作用特點分析

如表1 所示，共得到君＋臣藥組54 個化學成分、288 個靶點。與疾病靶點作交集，得到258 個共有靶點，具體成分及靶點見表2。258 個共有靶點中肉蓯蓉18 個化學成分對應216 個靶點，巴戟天39 個化學成分對應116 個靶點。258 個靶點中有243 個與雌激素低下相關（較君藥組增加39 個）、38 個有圍絕經期焦慮相關（較君藥組增加5 個）、147 個與生殖道萎縮相關（較君藥組增加17 個）、166 個與骨質疏松有關（較君藥組增加27 個），257 個參與了PPI 網絡。對PPI 網絡進行拓撲屬性分析，點度中心性和介數中心性均超過平均值的關鍵靶點共有47 個，分別為膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，G FA P）、三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白 G 2（ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2）、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、巴豆酰基轉移酶（histone acetyltransferase p300，EP300）、轉錄因子Sp1（transcription factor Sp1，SP1）、過氧化酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARA）、HIF1A、SOD1、MMP9、MAPK1、PRKCA、MYC、FOS、RELA、MAPK3、ATM、CXCL8、CCND1、FN1、AKT1、IL-1β、CASP8、CYP3A4、SPP1、JUN、CCNB1、VEGFA、IL-6、ESR1、INS、CAV1、PTGS2、GSTP1、PPARG、AR、CRP、HMOX1、ERBB2、CASP3、NOS3、EGFR、SOD2、STAT3、EGF、IL-2，如圖2 所示。對關鍵作用靶點進行GO 富集分析，君＋臣藥組治療圍絕經期綜合征的相關生物過程涉及化學刺激反應、調控發育過程、生物過程的正負調控、應激反應、組織增殖、細胞過程正負調控、調控細胞增殖、對類固醇激素刺激的反應等。排除廣泛通路，KEGG 通路富集分析結果顯示其相關通路主要富集在ER 信號通路（涉及10 個靶點）、PI3K-Akt 信號通路（涉及18 個靶點）、MAPK 信號通路（涉及17 個靶點）、HIF-1 信號通路（涉及16 個靶點）等。

圖1 君藥組作用特點網絡分析Fig.1 Network analysis of pharmacological characteristics of Jun group

圖2 君＋臣藥組作用特點網絡分析Fig.2 Network analysis of pharmacological characteristics of Jun and Chen group

3.3 君＋臣＋佐藥組作用特點分析

如表1 所示，共得到君＋臣＋佐藥組73 個化學成分、306 個靶點。與疾病靶點作交集，得到274 個共有靶點，具體成分及靶點見表2。274 個共有靶點中肉蓯蓉18 個化學成分對應216 個靶點，巴戟天39個化學成分對應116 個靶點，花椒7 個化學成分對應147 個靶點，牛膝16 個化學成分對應170 個靶點。274 個靶點中有258 個與雌激素低下相關（較君＋臣藥組增加15 個）、40 個有圍絕經期焦慮相關（較君＋臣藥組增加2 個）、153 個與生殖道萎縮相關（較君＋臣藥組增加6 個）、176 個與骨質疏松有關（較君＋臣藥組增加10 個），273 個參與了PPI 網絡。如圖3 所示，對PPI 網絡進行拓撲屬性分析，點度中心性和介數中心性值均超過平均值的關節靶點共有48 個，分別為絲裂原活化蛋白激酶8（mitogenactivated protein kinase 8，MAPK8）、細胞色素C（cytochrome C，CYCS）、載脂蛋白A1（apolipoprotein A1，APOA1）、CAT、MMP9、GSTP1、PPARA、AKT1、ESR1、SPP1、NOS3、FOS、SOD2、CCND1、MAPK3、ERBB2、CASP3、CYP3A4、CXCL8、EP300、EGFR、PPARG、AR、GJA1、IL-1β、BDNF、SP1、EGF、STAT3、PRKCA、CAV1、MAPK1、FN1、RELA、ATM、CASP8、JUN、HMOX1、PTGS2、VEGFA、MAPK14、ABCG2、IL-2、IL-6、INS、HIF-1α、MYC、SOD1。對關鍵作用靶點進行GO 富集分析，君＋臣＋佐藥組治療圍絕經期綜合征的相關生物過程涉及化學刺激反應、生物過程的正負調控、調控發育過程、細胞過程正負調控、應激反應、細胞凋亡的調節、代謝過程正負調控、組織增殖、對類固醇激素刺激的反應等。排除廣泛通路，KEGG 通路富集分析結果顯示其相關通路主要富集在ER 信號通路（涉及10 個靶點）、MAPK 信號通路（涉及18 個靶點）、PI3K-Akt 信號通路（涉及18 個靶點）、HIF-1 信號通路（涉及16 個靶點）等。

圖3 君＋臣＋佐藥組作用特點網絡分析Fig.3 Network analysis of pharmacological characteristics of Jun-Chen-Zuo group

3.4 君＋臣＋佐＋使藥（全方）組作用特點分析

如表1 所示，共得到君＋臣＋佐＋使藥（全方）組74 個化學成分、322 個靶點。與疾病靶點作交集，得到290 個共有靶點，具體成分及靶點見表2。290個共有靶點中肉蓯蓉18 個化學成分對應216 個靶點，巴戟天39 個化學成分對應116 個靶點，花椒7個化學成分對應147 個靶點，牛膝16 個化學成分對應170 個靶點，青鹽1 個化學成分對應19 個靶點。290 個共有靶點中有273 個與雌激素低下相關（較君＋臣＋佐藥組增加15 個）、40 個與圍絕經期焦慮相關（較君＋臣＋佐藥組未增加）、162 個與生殖道萎縮相關（較君＋臣＋佐藥組增加9 個）、182個與骨質疏松有關（較君＋臣＋佐藥組增加6 個），288 個參與了PPI 網絡。如圖4 所示，對PPI 網絡進行拓撲屬性分析，點度中心性和介數中心性值均超過平均值的靶點共有51 個，分別為趨化因子2（C-C motif chemokine 2，CCL2）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase，G6PD）、尿激酶型纖溶酶原激活物（ urokinase-type plasminogen activator，PLAU）、熱休克蛋白A4（heat shock protein A4，HSPA4）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、CCND1、ATM、MMP9、CYP3A4、EGFR、CXCL8、HIF-1α、PRKCA、PPARG、APOA1、STAT3、ESR1、CASP8、IL-2、CAT、PTGS2、SOD2、JUN、VEGFA、MYC、NOS3、RELA、BDNF、SOD1、CYCS、GSTP1、HMOX1、MAPK3、AR、ERBB2、MAPK14、EP300、FOS、CAV1、EGF、CASP3、MAPK1、IL-1β、MAPK8、SP1、PPARA、FN1、INS、SPP1、AKT1、IL-6。對關鍵作用靶點進行GO 富集分析，君＋臣＋佐＋使藥組治療圍絕經期綜合征的相關生物過程涉及化學刺激反應、應激反應、組織發育、生物過程的正負調控、細胞過程正負調控、細胞凋亡的調節、調節細胞增殖、對類固醇激素刺激的反應等。排除廣泛通路，KEGG通路富集分析結果顯示其相關通路主要富集在ER信號通路（涉及10 個靶點）、PI3K-Akt 信號通路（涉及18 個靶點）、MAPK 信號通路（涉及18 個靶點）、HIF-1 信號通路（涉及16 個靶點）等。

4 討論

網絡藥理學涉及生物信息學、計算機科學、網絡數據庫檢索等技術和知識，能預測出藥物與通路、疾病的相關性，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡，揭示多分子藥物協同作用機制，與中藥及其復方多成分、多靶點、多途徑協同作用的原理契合度較高，因此本研究采用網絡藥理學方法，將青鹽方拆方作用于圍絕經期綜合征分別進行靶點預測篩選及功能和通路富集分析，探索補腎方劑青鹽方治療圍絕經期綜合征的作用機制和配伍合理性。

圖4 君＋臣＋佐＋使藥（全方）組作用特點網絡分析Fig.4 Network analysis of pharmacological characteristics of Jun-Chen-Zuo-Shi group

本課題組前期開展的青鹽方治療圍絕經期焦慮癥的網絡分析[4]，為更廣泛獲得該方治療該疾病的潛在靶標，結合TCMIP v2.0 和Swiss Target Prediction 得到青鹽方45 個化合物對應的455 個潛在靶標信息，并進行初步實驗驗證。本研究采用TCMSP 數據庫中的相關靶點功能，并結合文獻發現及知識歸納篩選出青鹽方74 個潛在化學成分及322 個潛在靶標信息，旨在從網絡藥理學角度闡釋青鹽方防治圍絕經期的作用特點及配伍規律。各藥可通過多種成分、多個靶點、多種信號通路作用于圍絕經期綜合征，各藥之間既有重復，又互相補充，全方作用于圍絕經期綜合征的靶點290 個，其中關鍵靶點51 個，可通過化學刺激反應、應激反應、組織發育、生物過程的正負調控、細胞過程正負調控、細胞凋亡的調節、調節細胞增殖、對類固醇激素刺激的反應等生物過程作用于圍絕經期綜合征，主要通過影響細胞因子如AKT1、CCND1、凋亡調節劑B 淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2），炎癥因子如IL-1β、IL-10、CCL2，內分泌因子如BDNF、ESR1、AR 參與神經系統、內分泌系統、免疫系統等，從而作用于圍絕經期綜合征。KEGG通路富集結果顯示，青鹽方主要通過ER、PI3K-Akt、MAPK、HIF-1 等信號通路作用于圍絕經期綜合征。

肉蓯蓉作為方中君藥，囊括了全方290 個靶點中的216 個靶點，涉及圍絕經期焦慮、生殖道萎縮、骨質疏松各個不同癥狀和雌激素低下關鍵病理環節。在君藥基礎上依次增加臣、佐、使藥后，靶點個數和各通路所涉及的靶點均有不同程度的增加。君＋臣藥組作為方中的核心藥對，囊括了290 個靶點中258 個靶點，臣藥巴戟天在君藥基礎上增加了42 個靶點，尤以增加雌激素低下關鍵病理環節的靶點為最多，也涉及各個不同癥狀靶點的增加，提示君藥、君-臣藥對在方中的關鍵地位，對各個不同癥狀和雌激素低下關鍵病理環節均有防治作用。在君臣藥對基礎上加入佐藥花椒、牛膝后，增加了16 個靶點，涉及各個不同癥狀和關鍵病理環節均有增加，顯示其在方中“佐”的地位。在君、臣、佐藥基礎上增加使藥青鹽后增加了16 個靶點，在各個不同時期癥狀和關鍵病理環節均有涉及，如血清和糖皮質激素誘導蛋白激酶（serum/ glucocorticoid-regulated kinase 1，SGK1）[9]、乙酰膽堿轉移酶（cholin acetyltransferase，CHAT）[10]涉及神經-內分泌系統；炎癥因子高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）[11]、整合素β2（integrin beta 2，ITGB2）[12]涉及免疫、炎癥因子；G6PD[13]、15-羥基前列腺素脫氫酶（15-hydroxyprostaglandindehydrogenase，15-PGDH）[14]涉及細胞凋亡；碳酸酐酶1（carbonic anhydrase 1，CA1）[15]、碳酸酐酶2（carbonic anhydrase 2，CA2）[16]涉及骨代謝過程。表明青鹽作為引經藥，在方中潤燥潛降，引諸藥入腎經，可關聯多個圍絕經期綜合征涉及的系統及功能，增加君臣佐藥組在各個不同癥狀和關鍵病理環節的參與防治，起到引經報使的作用。

《素問·上古天真論》云：“女子七歲腎氣盛，齒更發長；二七而天癸至，任脈通……時至七七則任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也。”中醫認為婦女時至七七時，腎氣衰，天癸竭，進而出現“絕經前后諸癥”即圍絕經期綜合征，故腎虛是致圍絕經期綜合征之本。課題組前期多項研究發現，補腎方藥作用于圍絕經期綜合征與雌激素網絡有著密切聯系[2-3,17-19]。雌激素在整個生命過程中影響著雌性丘腦下部的活動，對性分化、發育和成熟均有影響，對骨代謝具有重要調節作用[20-21]。研究表明，方中肉蓯蓉、巴戟天、花椒、牛膝均含有雌激素樣作用的成分，如槲皮素（quercetin）作為肉蓯蓉、花椒、牛膝的共有成分，可與ESR1 結合發揮雌激素樣保護作用[22]，并調控雌激素受體下游底物和信號通路，通過雌激素受體介導的通路促進骨髓間充質干細胞的增殖和成骨向分化，改善骨組織結構和功能[23]。MAPK 信號通路可介導卵巢顆粒細胞增殖、分化、遷移、凋亡[24]。HIF-1 信號通路既可促進骨形成和血管形成[25]，又可增加破骨細胞的數量和破骨活性[26]。PI3K/Akt信號通路及其下游靶蛋白可參與骨形成和骨重建過程[27]。ErbB 信號通路可激活PI3K/Akt 途徑，促進神經干細胞分化，干預神經系統疾病[28]。調節VEGF 信號通路可改善腦部微循環與腦代謝異常，從而緩解焦慮、抑郁等情況[29]。p53 信號通路參與誘導子宮內膜細胞凋亡[30]，抑制原代海馬神經元細胞凋亡[31]。

本研究通過網絡藥理學方法，分析青鹽方中各拆方組合作用于圍絕經期綜合征的作用靶點及機制，揭示青鹽方作用于圍絕經期綜合征的作用機制及君、臣、佐、使配伍的合理性，為進一步探究其發揮作用的藥效物質基礎和作用機制提供方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突