五虎湯對RSV誘導的哮喘小鼠模型樹突細胞自噬和炎性因子IL-17A和IL-17F水平的影響

張 鑫，王孟清，羅銀河，江智豪

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208

2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

3.湖南中醫藥大學 中醫學國內一流建設學科，湖南 長沙 410208

支氣管哮喘是氣道慢性炎癥性疾病，近年兒童哮喘呈逐年增加的趨勢[1]。兒童哮喘與呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）密切相關，研究表明超過85%的兒童哮喘與RSV 感染有關[2]。RSV 感染人體后，肺中的抗原提呈細胞攝取抗原，樹突細胞被激活，此外，樹突細胞自噬功能的改變也會影響其抗原提呈功能，進而影響T 細胞分泌的炎性因子，從而誘發哮喘[3-6]。輔助性T 細胞1（T helper 1，Th1）、輔助性T 細胞2（T helper 2，Th2）細胞分泌的細胞因子和輔助性T 細胞17（T helper 17，Th17）分泌的白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）在哮喘的炎癥反應中發揮著重要作用[7]。五虎湯為治喘名方，可顯著改善哮喘患兒的氣道炎癥，課題組前期研究表明五虎湯可通過作用樹突細胞，從而調節Th1、Th2 細胞分泌的細胞因子水平[8-9]。本研究通過體內和體外實驗探討五虎湯對RSV 誘導的哮喘小鼠樹突細胞自噬的影響，以及對Th17 細胞分泌的炎性因子IL-17A 和IL-17F 水平的影響，揭示五虎湯改善哮喘氣道炎癥的機制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雌性BALB/c 小鼠88 只，6～8 周齡，體質量（20±2）g；SPF 級SD 雄性大鼠12 只，6周齡，體質量（200±5）g，購自湖南斯萊克景達動物實驗有限公司，許可證號 SCXK（湘）2016-0002。轉基因OT2 小鼠3 只，4 周齡，體質量（18±2）g，購自美國Jackson Laboratory，許可證號2061A00649。動物飼養于濕度（55±5）%、溫度（22±2）℃、12 h 亮/12 h 暗循環條件下，自由飲食飲水。動物實驗經湖南中醫藥大學動物倫理委員會批準（批準號20180810-02）。

1.2 細胞

RSV 病毒株和人喉表皮樣癌Hep-2 細胞由武漢大學醫學院病毒學研究所提供。

1.3 藥材

麻黃、苦杏仁、生石膏、甘草、細茶葉由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥房提供，經劉紹貴主任藥師鑒定分別為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinicaStapf 的干燥草質莖、薔薇科植物山杏Prunus armeniacaL.var.ansuMaxim.的干燥成熟種子、硫酸鹽類礦物硬石膏族石膏、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖、山茶科植物茶Camellia sinensis(L.) O.Ktze.的嫩葉。

1.4 藥品與試劑

雞卵清蛋白（ovalbumin，OVA，批號MP6110-1G）購自上海懋康生物科技有限公司；小鼠外周血淋巴細胞分離液試劑盒（批號P8620）購自北京索萊寶科技有限公司；乙酰膽堿（批號2260-50-6）購自上海禾午生物科技有限公司；雷帕霉素（批號S1039，質量分數＞98%）購自美國Selleck 公司；地塞米松（批號D1756，質量分數為99%）、DMSO（批號D2650-100ML）購自美國Sigma公司；蘇木精-伊紅（HE）染色液（批號P032IH）、中性樹膠（批號P033IH）、二甲苯（批號10023418）、無水乙醇（批號10009218）購自國藥控股湖南有限公司；微管相關蛋白輕鏈3I（microtubule-associated protein lightc hain 3I，LC3I）抗兔單抗（批號4599S）、微管相關蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）抗兔單抗（批號3868S）購自美國CST 公司；β-actin 抗小鼠單抗（批號YM3028）購自美國Immunoway 公司；IL-17A、IL-17F ELISA 試劑盒（批號分別為E20181109021、E20181109024）購自上海晶天生物科技有限公司；PBS 緩沖液（批號LM1711）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，批號0500）、RPMI 1640 培養基（批號0002）、重組人粒巨噬細胞集落刺激因子（批號kx30-GM）、重組人白細胞介素4（批號rh114）、Opti-MEM 培養基（批號1967689）購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司；PE/Cy7 抗小鼠CD69抗體（批號104511）、APC 抗小鼠CD3 抗體（批號100235）、PE 抗小鼠CD4 抗體（批號100407）購自美國Biolegend 公司；CD11cPerCP-Cyanine5.5/APC/PE 抗體（批號130-102-413）、小鼠CD4（L3T4）微珠（批號130-117-043）、肺分離試劑盒、CD11c MicroBeads UltraPure 購自德國Miltenyi 公司；紅細胞裂解液（批號S371KJ）購自上海源培生物科技股份有限公司；熒光染料CFSE（批號HY-D0938）購自美國MCE 公司；OVA-17 肽（批號BP015382）購自武漢百意欣生物技術有限公司。

1.5 儀器

S888E 超聲波霧化器（南京道芬電子有限公司）；DHX-50 小動物呼吸機（成都儀器廠）；YT-6C生物組織攤鋪機（孝感宏翔生物醫械技術有限公司）；BE41 光學顯微鏡（蘇州勝視電子設備有限公司）；DYY-6C 電泳儀（北京六一儀器廠）；YH-C3001電子天平（五鑫衡器有限公司），TS-2 水平脫色搖床（上海皖寧公司）；EASY15 純水儀（力康生物醫療科技控股有限公司）；12008007 臺式離心機（金壇市大地自動化儀器廠）；DK-600S 恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司），BC-J160S 細胞培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；75004250 高速離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；DS-Ri2 高級分析倒置顯微鏡（美國Nikon 公司）；MACSQuant Analyzer 流式細胞儀（德國Miltenyi公司）；Transwell 小室（6.5 mm）、T25 細胞培養瓶（美國Corning 公司）。

2 方法

2.1 五虎湯的制備

依據朱丹溪《幼科全書》中的藥物與劑量配方，取麻黃2.4 g、杏仁6.0 g、生石膏9.0 g、生甘草2.4 g、細茶葉4.8 g，加入5 倍量蒸餾水浸泡30 min，回流提取40 min，濾過，再加入5 倍量蒸餾水，回流提取40 min，合并2 次提取液，用旋轉蒸發儀濃縮成2.46 kg/L（以生藥量計）原液。原液用作高劑量組，原液以等體積生理鹽水稀釋作為中劑量組，原液以3 倍體積生理鹽水稀釋作為低劑量組。

2.2 RSV 誘導哮喘小鼠模型的建立

78 只BALB/c 小鼠適應性飼養7 d 后，隨機分為對照組（14 只）和模型組（64 只），參照課題組前期研究[9]造模。于實驗第1、2 天，模型組小鼠鼻腔滴入0.1 mL RSV（2.4×106PFU/mL），同時ip 0.25 mL 1% OVA（以生理鹽水配制）；對照組小鼠鼻腔滴入0.1 mL Hep-2 細胞滴，同時ip 等體積生理鹽水。自實驗第9 天，每天9: 00 時將小鼠放入霧化吸入箱中，模型組給予1% OVA 霧化以激發哮喘，對照組給予等體積生理鹽水霧化，隔天1次，每次30 min，連續14 d。

致敏前后每3 天稱定小鼠體質量，并觀察小鼠有無搔鼻、點頭樣喘息等行為學變化。最后1 次造模24 h 后分別從對照組和模型組隨機取4 只小鼠，進行氣道反應性實驗。小鼠麻醉后待四肢松弛，固定消毒，外科剪切開頸部皮膚，暴露氣管，用靜脈留置針行頸靜脈穿刺并固定，V 行剪開氣管，予深靜脈穿刺針行氣管插管，接小動物呼吸機切開氣管插管固定。呼吸機參數調整為呼吸頻率為75 次/min，潮氣量為8 mL/kg。記錄氣道壓力、氣道流量和潮氣量的變化。小鼠氣道壓力穩定后給予0.1 mL 不同質量濃度（0、6.25、12.50、25.00、50.00 μg/mL）乙酰膽堿霧化，收集吸入乙酰膽堿5～60 s 的數據，采用動物肺功能分析軟件計算用藥后的最大肺阻力，與對照組比較，模型組肺阻力顯著升高則表明造模成功。

2.3 分組與給藥

將造模后的小鼠隨機分為對照組、模型組、地塞米松（1.82 mg/kg）組、雷帕霉素（1 mg/kg）組、五虎湯低劑量（1.6 g/kg，相當于臨床1/2 劑量）組、五虎湯中劑量（3.2 g/kg，相當于臨床等效劑量）組、五虎湯高劑量（6.4 g/kg，相當于臨床2 倍劑量）組，每組10 只。五虎湯組ig 五虎湯（20 mL/kg），并ip生理鹽水；地塞米松、雷帕霉素組ip 0.4 mL 相應藥物，并ig 等體積生理鹽水；對照組和模型組ig 等體積生理鹽水，并ip 等體積生理鹽水，1 次/d，連續14 d。

2.4 五虎湯對RSV 小鼠肺泡灌洗液中IL-17A 和IL-17F 水平的影響

末次給藥后48 h，小鼠脫頸椎處死，分離肌肉，暴露氣管，在氣管上剪一個T 形口，插入自制的氣管，注入1 mL PBS 至肺部組織，輕揉后吸出，2500 r/min 離心10 min，吸取上清液。按照IL-17A、IL-17F ELISA 試劑盒說明書檢測小鼠肺泡灌洗液中IL-17A 和IL-17F 水平。

2.5 五虎湯對RSV 小鼠肺組織病理的影響

取小鼠肺組織，將1 mL 4%多聚甲醛注入氣管，全肺浸泡4%多聚甲醛24 h。常規石蠟包埋、切片后進行HE 染色，觀察肺組織的病理變化。

2.6 五虎湯對RSV 小鼠肺組織中自噬小體的影響

取小鼠肺組織，用2.5%戊二醛緩沖液固定4 h，再用0.1 mol/L 磷酸洗滌10 min，重復3 次。1%鋨酸固定2 h，梯度乙醇脫水、環氧樹脂包埋，于30 ℃烘箱中過夜后再于60 ℃烘箱內放置12 h，切片（厚100 nm）后用醋酸鈾、硝酸鉛染色，于透射電鏡下觀察肺組織中的自噬小體。

2.7 五虎湯對RSV 小鼠肺組織樹突細胞中自噬相關蛋白表達的影響

2.7.1 肺組織中樹突細胞的分離 小鼠肺組織剪碎后，將小鼠肺組織解離成單細胞混懸液，在MACS SmartStrainers 中去除細胞團塊，采用CD11c MicroBeadsUltraPure 分選磁珠從肺單細胞混懸液中分選獲得樹突細胞。

2.7.2 Western blotting 法檢測樹突細胞中自噬相關蛋白的表達 樹突細胞提取總蛋白，BCA 法測定蛋白質量濃度，蛋白樣本經SDS-PAGE 電泳，轉至PVDF 膜，5%牛奶封閉1 h，分別加入LC3I（1∶2000）、LC3II（1∶1000）、β-actin（1∶5000）抗體孵育過夜，TBST 洗滌3 次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 次，每次10 min。采用凝膠成像系統成像掃描，用Quantity One 軟件進行灰度分析。

2.8 樹突細胞的分離與鑒定

將10 只BALB/c 小鼠脫頸椎處死，浸泡于75%酒精中。于無菌操作臺分離小鼠股骨、脛骨，剝除結締組織，暴露髓腔，用PBS 緩沖液反復沖洗髓腔，收集骨髓濾液，離心后棄上清，加入紅細胞裂解液裂解2 min，1000 r/min 離心5 min，棄上清，PBS緩沖液洗滌后加入RPMI 1640 培養基（含10 ng/mL重組人粒巨噬細胞集落刺激因子、1 ng/mL 重組人白細胞介素4、1% FBS、1%雙抗），接種于6 孔板中培養。第3 天起每天更換一半培養基，第7 天收集細胞，以PBS緩沖液調整樹突細胞密度至1×106個/mL，加入CD11ccPerCP-Cyanine5.5/APC/PE 抗體，采用流式細胞儀進樣分析。

2.9 五虎湯含藥血清的制備與劑量篩選

2.9.1 五虎湯含藥血清的制備 將12 只SD 大鼠隨機分為對照組及五虎湯低劑量（1.1 g/kg，相當于臨床1/2 劑量）、中劑量（2.2 g/kg，相當于臨床等效劑量）、高劑量（4.4 g/kg，相當于臨床2 倍劑量）組，每組3 只。對照組ig 生理鹽水（10 mL/kg），各給藥組ig 等體積藥物，2 次/d，連續7 d。末次給藥后禁食，各組大鼠腹主動脈取血，離心取上清液，血清滅活后濾過，分別用作空白血清和五虎湯低、中、高劑量含藥血清，于-80 ℃保存備用。

2.9.2 含藥血清最佳劑量的篩選 樹突細胞以含RSV 的Opti-MEM 培養基培養24 h，以PBS 洗滌后，隨機分為空白血清組和含藥血清低、中、高劑量組。各組分別加入5%、10%、20%、30%含藥血清，孵育24 h 后采用臺盼藍染色法計算細胞存活率。

2.10 CD4＋T 細胞分離和CFSE 標記

3 只OT2 小鼠脫頸椎處死，浸泡于75%乙醇中。于無菌操作臺取小鼠脾臟，研磨過200 目篩網，收集濾液，1500 r/min 離心5 min，棄上清。取4 支15 mL 離心管，每管加入4 mL 小鼠外周血淋巴細胞分離液，將外周血細胞沉淀加入離心管中，加入10 mL PBS 洗滌細胞，離心10 min，棄上清，濾過后收集濾液，250×g離心10 min。每1×107個細胞加入90 μL Buffer 溶液（PBS、pH 7.2、0.5%牛血清白蛋白、2 mmol/L EDTA）和10 μL CD4 抗體，于4 ℃孵育10 min，用于免疫磁珠分選。

無菌操作臺中，將分選柱吸附在分選器上，分選柱下放置15 mL 離心管，向分選柱中加入3 mL Buffer溶液待其自然濾過，將分選柱置于15 mL 離心管中，向分選柱中加入5 mL Buffer 溶液，待所有液體全部濾下時，使用助推器推下分選柱內殘余液體，離心管內液體即為CD4+T 淋巴細胞懸液。1000 r/min 離心5 min，棄上清，加入5 mL PBS 洗滌，加入含10%FBS 的RPMI 1640 培養基重懸細胞懸液，接種于T25細胞培養瓶中。用含0.1% BSA 的PBS 溶液調整細胞密度為1×106/mL，加入1 μL CFSE 儲存液，于37 ℃培養箱中孵育30 min，于冰上孵育5 min，1000 r/min 離心5 min，棄上清，重復3 次。

2.11 五虎湯對CD4＋T 細胞增殖和T 細胞活化標志物CD69 表達的影響

“2.8”項中分離的樹突細胞以1×104/孔接種于Transwell 小室下室，“2.10”項中分離的CD4+T 細胞以1×105/孔接種于Transwell 小室上室。設置對照組，模型組，五虎湯低、中、高劑量含藥血清組，雷帕霉素（10 ng/mL）組，對照組加入完全培養基，其他組加入含RSV 的Opti-MEM 培養基，培養24 h，PBS 洗滌后加入OVA-17 肽，培養24 h，構建RSV誘導的樹突細胞自噬模型。對照組與模型組加入空白血清，含藥血清低、中、高劑量組分別加入20%相應含藥血清，雷帕霉素組加入雷帕霉素，培養24 h。收集細胞，分別加入 CD4-PE、CD3-APC 和CD69-PE/Cy7 抗體，流式細胞術分析CD4＋T 細胞的增殖與CD69 的表達情況。

2.12 統計分析

實驗數據采用SPSS 25.0 軟件進行統計分析，數據結果采用表示。兩組數據比較，滿足正態性和方差齊性，用配對t檢驗，多組比較滿足正態性和方差齊性的計量資料采用One-way ANOVA，各組間兩兩比較采用 LSD 法，方差不齊者用Dunett’s 檢驗。

3 結果

3.1 RSV 誘導哮喘小鼠模型的驗證

與對照組比較，模型組小鼠體質量減輕，出現呼吸快、搔鼻、豎毛、聳肩、上肢縮抬、點頭樣喘息等行為學改變。如表1 所示，與對照組比較，吸入不同質量濃度（0、6.25、12.50、25.00、50.00 μg/mL）乙酰膽堿后，模型組小鼠肺阻力顯著增加（P＜0.01），表明造模成功。

3.2 五虎湯對RSV 小鼠肺組織病理變化的影響

如圖1 所示，對照組小鼠支氣管管腔壁完整，未見脫落的上皮細胞，支氣管黏膜平整，平滑肌無炎性細胞浸潤；模型組小鼠支氣管管壁增厚，氣道變窄，氣道和血管周圍有大量的炎癥細胞浸潤，以嗜酸粒細胞和中性粒細胞為主；五虎湯各劑量組、地塞米松組、雷帕霉素組小鼠肺組織炎癥表現均減輕，支氣管管腔內可見少量黏液和脫落，炎性細胞浸潤較模型組明顯減輕。

表1 對照組與模型組小鼠肺阻力比較 ()Table 1 Comparison of airway reactivity in mice between control group and model groups ()

表1 對照組與模型組小鼠肺阻力比較 ()Table 1 Comparison of airway reactivity in mice between control group and model groups ()

與對照組比較：**P＜0.01**P < 0.01 vs control group

乙酰膽堿/(μg·L-1) 肺阻力/(cm H2O·mL·s)對照 模型00 02.13±0.20 2.45±0.19 06.25 03.91±0.40 11.14±1.11**12.50 06.44±0.72 15.91±1.00**25.00 09.09±0.83 21.90±1.22**50.00 12.71±0.69 29.42±2.12**

圖1 五虎湯對RSV 小鼠肺組織病理的影響 (HE,×200)Fig.1 Effect of Wuhu Decoction on lung pathology of RSV mice (HE,× 200)

3.3 五虎湯對RSV 小鼠肺組織自噬小體的影響

如圖2 所示，與對照組比較，模型組、各給藥組小鼠肺組織自噬小體增多。

3.4 五虎湯對RSV 小鼠肺組織樹突細胞中自噬相關蛋白表達的影響

如圖3 和表2 所示，與對照組比較，模型組小鼠樹突細胞中LC3Ⅱ/LC3I蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，五虎湯低、中、高劑量組和雷帕霉素組小鼠樹突細胞中LC3Ⅱ/LC3I蛋白表達水平顯著增高（P＜0.01）。

圖2 五虎湯對RSV 小鼠肺組織自噬小體的影響Fig.2 Effect of Wuhu Decoction on pulmonary autophagosome of RSV mice

圖3 五虎湯對RSV 小鼠肺組織樹突細胞中LC3I 和LC3Ⅱ蛋白表達的影響Fig.3 Effect of Wuhu Decoction on expressions of LC3I and LC3Ⅱ in dendritic cells in lungs of RSV mice

3.5 五虎湯對RSV 小鼠肺泡灌洗液中IL-17A 和IL-17F 水平的影響

如表3 所示，與對照組比較，模型組小鼠肺泡灌洗液中IL-17A 和IL-17F 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松組、雷帕霉素組、五虎湯中、高劑量組小鼠肺泡灌洗液中IL-17A 和IL-17F 水平顯著降低（P＜0.05、0.01），五虎湯低劑量組IL-17A 水平顯著降低（P＜0.01）。

表2 五虎湯對RSV 小鼠肺組織樹突細胞中LC3I 和LC3Ⅱ蛋白表達的影響 ()Table 2 Effect of Wuhu Decoction on expressions of LC3I and LC3Ⅱ in dendritic cells in lungs of RSV mice ()

表2 五虎湯對RSV 小鼠肺組織樹突細胞中LC3I 和LC3Ⅱ蛋白表達的影響 ()Table 2 Effect of Wuhu Decoction on expressions of LC3I and LC3Ⅱ in dendritic cells in lungs of RSV mice ()

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：△△P＜0.01**P < 0.01 vs control group；△△P < 0.01 vs model group

組別 劑量/(g·kg-1) 蛋白相對表達量LC3I LC3II LC3II/LC3I對照 — 0.32±0.02 0.08±0.01 0.26±0.01模型 — 0.54±0.04** 0.40±0.05** 0.73±0.06**五虎湯 1.6 0.54±0.01 0.95±0.01△△ 1.75±0.06△△3.2 0.85±0.02△△ 1.29±0.01△△ 1.51±0.04△△6.4 1.10±0.02△△ 1.28±0.01△△ 1.16±0.02△△地塞米松 0.00 182 0.58±0.03 0.43±0.06 0.74±0.09雷帕霉素 0.00 100 0.11±0.01△△ 0.63±0.02△△ 6.03±0.71△△

表3 五虎湯對RSV 小鼠肺泡灌洗液中IL-17A 和IL-17F 水平的影響 ()Table 3 Effect of Wuhu Decoction on levels of inflammatory cytokines IL-17A and IL-17F in bronchoalveolar lavage fluid of RSV mice ()

表3 五虎湯對RSV 小鼠肺泡灌洗液中IL-17A 和IL-17F 水平的影響 ()Table 3 Effect of Wuhu Decoction on levels of inflammatory cytokines IL-17A and IL-17F in bronchoalveolar lavage fluid of RSV mice ()

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：△P＜0.05 △△P＜0.01**P < 0.01 vs control group；△P < 0.05 △△P < 0.01 vs model group

組別 劑量/(g·kg-1) IL-17A/(ng·L-1) IL-17F/(ng·L-1)對照 — 58.69±7.65 59.39±6.96模型 — 182.39±8.30** 140.39±3.11**五虎湯 1.6 121.46±5.55△△ 132.53±4.36 3.2 111.37±7.81△△ 109.93±10.49△△6.4 148.13±10.90△△ 117.80±15.15△地塞米松 0.00 182 103.13±10.99△△ 97.00±9.13△△雷帕霉素 0.00 100 86.37±11.69△△ 87.97±5.36△△

3.6 樹突細胞的分離與鑒定

從小鼠骨髓中分離的樹突細胞在培養基中懸浮生長，培養至第7 天，如圖4 所示，鏡下可見細胞邊緣有樹突樣突起，具有典型的樹突細胞形態。如圖5 所示，從小鼠骨髓中分離培養的樹突細胞純度為99.3%。

3.7 五虎湯含藥血清最佳劑量的篩選

如圖6 所示，20%五虎湯含藥血清對細胞存活率較高，選取20%含藥血清進行后續實驗。

圖4 小鼠骨髓來源樹突細胞的形態 (×200)Fig.4 Morphology of mice bone marrow derived dendritic cells ( × 200)

圖5 小鼠骨髓來源樹突細胞的鑒定Fig.5 Identification of mice bone marrow-derived dendritic cells

3.8 五虎湯對CD4＋T 細胞增殖和CD69 表達的影響

如圖7、8 和表4 所示，與對照組比較，模型組CD4＋T 細胞增殖和T 細胞活化標志物CD69 表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，中、高劑量含藥血清組和雷帕霉素組CD4＋T 增殖和CD69表達顯著降低（P＜0.05、0.01），低劑量含藥血清組CD4＋T 增殖顯著降低（P＜0.01）。表明五虎湯含藥血清在體外具有抑制RSV 誘導的T 細胞增殖活化的能力。

4 討論

圖6 五虎湯含藥血清對樹突細胞活力的影響Fig.6 Effect of drug-containing serum of Wuhu Decoction on dendritic cell activity

圖7 對照組 (A)，模型組 (B)，五虎湯低、中、高劑量含藥血清組 (C～E) 和雷帕霉素組 (F) CD4＋T 細胞的流式結果Fig.7 Flow results of CD4＋T cells in control group (A),model group (B),drug-containing serum low,medium,high dose of Wuhu Decoction group (C—E) and rapamycin group (F)

氣道炎癥是支氣管哮喘重要的發病機制，樹突細胞介導的CD4＋T 淋巴細胞的增殖活化與氣道炎癥密切相關[10-11]。抗原的識別與遞呈、炎癥細胞的趨化、T 細胞的分化及其細胞因子的產生是哮喘炎癥反應的重要環節[12]。樹突細胞為肺中最重要的抗原呈遞細胞，成熟后可提呈抗原，激活分化初始T 細胞[13]。研究表明，哮喘患者的樹突細胞與自體T 細胞共培養促進T 細胞分泌IL-4、IL-5、IL-9 和IL-13，提示樹突細胞通過影響T 細胞分泌的炎性因子，誘發氣道炎癥，從而參與哮喘發病[14]。自噬是細胞利用溶酶體降解自身物質以適應生存環境的過程，病毒感染誘發機體細胞自噬，機體可通過提高自噬清除病毒[15]。自噬影響樹突細胞的抗原提呈功能，樹突細胞攝取、加工提呈抗原需要高水平的內吞和溶酶體活性，樹突細胞自噬功能紊亂引起的T 細胞炎性因子分泌變化可能是哮喘的發病機制之一[16-17]。

表4 五虎湯對CD4＋T 細胞增殖和CD69 表達的影響()Table 4 Effect of Wuhu Decoction on proliferation of CD4＋T cells and expression of CD69 ()

表4 五虎湯對CD4＋T 細胞增殖和CD69 表達的影響()Table 4 Effect of Wuhu Decoction on proliferation of CD4＋T cells and expression of CD69 ()

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：△P＜0.05 △△P＜0.01**P < 0.01 vs control group；△P < 0.05 △△P < 0.01 vs model group

組別 CD4＋T/% CD69 相對表達量對照 09.72±0.22 06.26±0.18模型 81.70±0.42** 16.73±0.37**含藥血清 66.30±0.54△△ 15.57±0.47 52.40±0.33△△ 10.70±0.64△54.90±0.29△△ 11.67±0.69△雷帕霉素 18.10±0.40△△ 10.63±0.19△△

五虎湯是治療兒童哮喘的名方，由麻黃、杏仁、石膏、甘草、細茶葉組成，有清肺平喘的功效。本研究采用RSV 與OVA 建立哮喘小鼠模型，以自噬誘導劑雷帕霉素作為陽性對照，觀察五虎湯是否可以通過影響小鼠肺中樹突細胞的自噬水平治療哮喘，結果表明RSV 誘導的哮喘小鼠肺部可見炎性細胞浸潤，各給藥組小鼠肺部炎癥減輕；模型組小鼠肺樹突細胞自噬標志蛋白LC3Ⅱ/LC3I表達水平顯著升高（P＜0.01），雷帕霉素和五虎湯組樹突細胞的自噬水平進一步升高（P＜0.01），提示五虎湯可以提高哮喘小鼠肺中樹突細胞細胞的自噬水平。

IL-17 是Th17 細胞分泌的重要細胞因子，具有募集粒細胞、促進其他炎性細胞因子釋放的作用[18-19]。IL-17 參與機體多種炎癥與免疫性疾病，在RSV 誘導的哮喘小鼠肺組織中IL-17 水平明顯升高[20-21]。IL-17 家族包含IL-17A～F，IL-17F 與IL-17A的同源性達50%，二者功能類似[22-23]。IL-17A 可通過促進成纖維細胞和氣道上皮細胞釋放細胞因子活化中性粒細胞，并使中性粒細胞在氣道募集，還可促進氣道上皮細胞黏蛋白表達，促進黏液分泌[24]。IL-17F 可刺激支氣管上皮細胞促進細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1）表達，并刺激IL-17 分泌使炎性細胞募集，同時對氣道高反應性與氣道重塑有重要影響[25-26]。IL-17A 和IL-17F通過促進前炎性細胞因子的釋放來放大炎癥反應，均可作為T 細胞誘導炎癥反應的早期啟動因子，研究認為IL-17A 在類風濕性關節炎發病中更為重要，IL-17F 對消化道嚙齒枸櫞酸桿菌感染與免疫的機制更為重要[27-28]。本研究結果顯示，RSV 誘導的哮喘小鼠肺泡灌洗液中IL-17A和IL-17F水平均顯著升高（P＜0.01），經五虎湯治療后二者水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），以五虎湯中劑量為佳，IL-17A 水平的變化較IL-17F 更為顯著，推測在RSV 誘導的哮喘模型中IL-17A 可能更適合作為病情變化的指標。

圖8 對照組 (A)，模型組 (B)，五虎湯低、中、高劑量含藥血清組 (C～E) 和雷帕霉素組 (F) 的CD69 表達的流式結果Fig.8 Flow cytometry of CD69 expression in control group (A),model group (B),drug-containing serum low,medium,high dose of Wuhu Decoction group (C—E),and rapamycin group (F)

為了進一步研究炎性因子IL-17A、IL-17F 的變化是否由樹突細胞自噬直接介導，體外采用RSV 感染樹突細胞與T 細胞共培養，發現CD4＋T 細胞增殖水平和T 細胞活化標志物CD69 表達升高，五虎湯含藥血清與自噬誘導劑雷帕霉素組CD4＋T 細胞增殖和CD69 的表達均顯著降低（P＜0.05、0.01），表明五虎湯可通過作用樹突細胞，抑制過度活化增殖的T 細胞。

綜上所述，樹突細胞的自噬水平與細胞因子IL-17A 和IL-17F 的分泌有關，RSV 可誘導哮喘小鼠肺組織樹突細胞自噬水平升高，使IL-17A、IL-17F水平上升，介導炎癥反應。五虎湯可通過上調RSV誘導的哮喘小鼠的自噬水平，進而降低IL-17A、IL-17F 等炎性細胞因子的表達，改善氣道炎癥，從而發揮治療RSV 誘發哮喘的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突