基于多指標質量差異關鍵屬性優化厚樸產地加工“發汗”工藝

劉 暢，王 瀟，劉 芳*，劉紹，胡慧玲，傅超美*，鄧 彬

1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137

2.成都地奧制藥集團有限公司，四川 成都 610000

厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.或凹葉厚樸M.officinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮[1]，具有下氣除滿、燥濕消痰的功效，常用于治療痰飲喘咳、食積氣滯、脘痞吐瀉及腹脹便秘等。厚樸的生理活性成分包括木脂素類、苷類、生物堿類及揮發油等[2-3]?，F代藥理研究表明，厚樸具有抗炎、抗菌、抗氧化及調節胃腸運動等作用[4-5]。

為了確保厚樸飲片的品質及療效，傳統認為厚樸干皮須進行“發汗”處理，以內表面變紫褐色或棕褐色為佳。“發汗”是保障厚樸道地性及藥效的關鍵環節之一，厚樸經過“發汗”處理后，其外觀、內在成分含量、藥效均發生改變[6-7]，但部分產地厚樸存在未“發汗”處理或“發汗”工藝錯亂不一的現象[7]，而《中國藥典》2020年版所記載的厚樸“發汗”工藝（干皮置沸水中微煮后，堆積“發汗”后干燥）也沒有可以客觀量化的具體參數，不利于厚樸“發汗”質量控制。課題組前期研究發現，厚樸“發汗”后有效成分含量發生變化[5-8]，與藥效有關的差異成分[9-12]主要為厚樸酚、和厚樸酚、木蘭花堿、紫丁香苷及厚樸苷A。本實驗以此5 個質量差異關鍵標志物為指標，擬對厚樸“發汗”過程中的關鍵過程即水煮時間、堆積天數、干燥溫度、干燥時間4 項因素加以考察，并采用CRITIC-層次分析法（CRITIC-AHP）復合加權法計算厚樸飲片中紫丁香苷、木蘭花堿、厚樸苷A、和厚樸酚及厚樸酚的相關權重，結合Box-Behnken 設計-響應面法（BBD-RSM），優選厚樸“發汗”工藝，為規范厚樸“發汗”工藝提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HTP-312 萬分之一電子天平，上海花潮電器有限公司；CPA225D 十萬分之一天平，賽多利斯科學儀器北京有限公司；101-2AB 電熱鼓風干燥箱，成都中興偉業儀器有限公司；UPK-I-107 優普系列超純水器，四川優普超純科技有限公司；Ultimate3000高效液相色譜儀，德國賽默飛公司。

1.2 材料

對照品紫丁香苷（批號19041510，質量分數＞98%）、木蘭花堿（批號19031409，質量分數＞98%）、和厚樸酚（批號19022708，質量分數＞98%）、厚樸酚（批號19022605，質量分數＞98%），成都益順達有限公司；對照品厚樸苷 A（批號DST191110-243，質量分數≥96%），成都德思特生物技術有限公司。乙腈、甲醇均為色譜純，成都科隆化學品有限公司；水為超純水；其他制劑均為分析純。

厚樸干皮收采于四川省綿陽市平武縣（2020年7月1日），經成都中醫藥大學標本中心實驗師連艷鑒定為木蘭科木蘭屬植物厚樸M.officinalisRehd.et Wils.的干燥干皮。

2 方法與結果

2.1 厚樸“發汗”工藝考察設計方法

《中國藥典》2020年版記載的厚樸“發汗”工藝[1]為干皮置沸水中微煮后，堆置陰濕處，“發汗”至內表面變紫褐色或棕褐色時，蒸軟，取出，卷成筒狀，干燥。本實驗在預實驗的基礎上，考察水煮時間（A）、堆積天數（B）、干燥溫度（C）、干燥時間（D）4 項因素。具體“發汗”工藝過程為將新鮮厚樸置沸水中微煮一定時間，陰涼通風處堆積一定時間，取出在陰涼通風處晾曬7 d 后，放入設定溫度的烘箱中干燥一定時間。具體工藝參數見表1。

表1 厚樸“發汗”工藝考察因素水平表Table 1 Investigation factor level table of “sweating”process of Magnoliae Officinalis Cortex

2.2 厚樸“發汗”工藝考察指標

本實驗基于對厚樸“發汗”前后有效成分的含量變化[4-5,7,9]、網絡藥理學預測[11]及藥理活性[10,12-14]，篩選確定厚樸酚、和厚樸酚、紫丁香苷、厚樸苷A、木蘭花堿5 個成分為厚樸飲片“發汗”前后質量差異關鍵標志物，并作為本實驗的“發汗”工藝考察指標。采用HPLC 法測定5 個成分的含量。

2.2.1 HPLC 含量測定方法的建立

（1）色譜條件：色譜柱為Acclaim120 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫0～5 min，5%乙腈；5～20 min，5%～20%乙腈；20～30 min，20%～70%乙腈；30～35 min，70%～80%乙腈；35～40 min，80%乙腈；40～45 min，80%～5%乙腈；體積流量0.8 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；檢測波長為265 nm（紫丁香苷、木蘭花堿）、294 nm（厚樸苷A、厚樸酚、和厚樸酚）。對照品、供試品HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品 (A) 和“發汗”厚樸樣品 (B) 的HPLC圖譜Fig.1 HPLC determination of control mixture (A) and sweated Magnoliae Officinalis Cortex (B)

（2）對照品溶液的制備：精密稱取對照品厚樸酚、和厚樸酚、紫丁香苷、厚樸苷A、木蘭花堿適量，加70%甲醇配制成含厚樸酚0.935 mg/mL、和厚樸酚0.700 mg/mL、紫丁香苷0.390 mg/mL、厚樸苷A 0.738 mg/mL、木蘭花堿0.460 mg/mL 的混合對照品溶液。

（3）供試品溶液的制備：精密稱取厚樸粉末（過三號篩）0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱定質量，密封，超聲輔助提取40 min，放冷，稱定質量，加70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，濾液經0.22 μm 濾膜濾過，即得。

（4）線性關系考察：精密移取“2.2.1（2）”項下混合對照品溶液5 mL，置于10 mL 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，依次稀釋對照品質量濃度，即得系列不同質量濃度的對照品溶液。精密吸取系列不同質量濃度對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以各對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，進行回歸分析，得到各指標成分的回歸方程、相關系數（r）及線性范圍分別為厚樸酚Y＝298.66X＋3.019 1，14.609～935.000 μg/mL，r＝0.999 8；和厚樸酚Y＝341.13X＋1.742 1，10.938～700.000 μg/mL，r＝0.999 6；紫丁香苷Y＝519.53X－0.589 8，12.188～390.000 μg/mL，r＝0.999 9；厚樸苷AY＝206.36X－0.103 8，23.047～736.000 μg/mL，r＝1.000 0；木蘭花堿Y＝329.35X＋0.072 5，14.375～460.000 mg/mL，r＝1.000 0。

（5）精密度試驗：取“2.2.1（2）”項下混合對照品溶液，按“2.2.1（1）”項下色譜條件進樣檢測，連續進樣6 次。計算厚樸酚、和厚樸酚、紫丁香苷、木蘭花堿及厚樸苷A 峰面積的RSD 分別為0.17%、0.09%、1.82%、1.04%、1.24%，結果表明儀器精密度良好。

（6）重復性試驗：取同一批供試品粉末（5 號樣品），平行6 份。按“2.2.1（3）”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1（1）”項下色譜條件依次進樣檢測。計算厚樸酚、和厚樸酚、紫丁香苷、木蘭花堿及厚樸苷A 峰面積的RSD 分別為0.09%、0.03%、1.691%、0.78%、1.26%，表明本實驗重復性良好。

（7）穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液（5號樣品），按“2.2.1（1）”項下色譜條件在0、2、4、8、16、24 h 分別進樣測定。計算厚樸酚、和厚樸酚、紫丁香苷、木蘭花堿及厚樸苷A 峰面積的RSD 分別為0.10%、0.04%、1.76%、0.82%、1.23%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

（8）加樣回收率試驗：取已知各指標成分含量的厚樸供試品（5 號樣品）適量，共6 份，每份0.25 g，精密稱定，分別加入等量的厚樸酚、和厚樸酚、紫丁香苷、木蘭花堿及厚樸苷A 對照品，按“2.2.1（3）”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1（1）”項下色譜條件測定，計算得到紫丁香苷、木蘭花堿、厚樸苷A、和厚樸酚、厚樸酚的平均加樣回收率分別為98.96%、99.28%、99.56%、98.88%、99.79%，RSD 分別為0.53%、1.58%、0.87%、0.21%、0.29%。

2.2.2 指標成分的含量測定 精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。通過標準曲線回歸方程計算各指標成分含量。

2.3 “發汗”厚樸評價指標權重的建立

2.3.1 CRITIC 法計算權重 CRITIC 法是基于評價指標的對比強度和沖突性來綜合衡量指標客觀權重的計算方法[15-16]。將各成分測定的含量數據由公式［評價指標值＝(實測值－最小值)/(最大值－最小值)］進行處理，根據SPSSAU 20.0 軟件處理數據得到相關系數矩陣，由綜合權重（Cj）計算公式和客觀權重（Wj），計算公式得到紫丁香苷、木蘭花堿、厚樸苷A、和厚樸酚及厚樸酚5 項指標的權重系數分別為0.069、0.042、0.384、0.211、0.294。式中rij表示指標i（i＝1，2，3，n）和j之間的相關系數，δj為標準化后列向量的標準差。

2.3.2 AHP 法計算權重 AHP 層次分析法是一種需要人為判斷各指標的優選順序的主觀權重計算方法[16-17]。根據厚樸“發汗”前后各指標成分的含量變化，將各指標成分含量作為權重指標予以量化，即5 項指標3 個層次，確定各指標的優先順序為厚樸酚＝和厚樸酚＞紫丁香苷＝厚樸苷A＞木蘭花堿，構建優先判斷矩陣并確定各項指標的相對評分。根據評分結果，紫丁香苷、木蘭花堿、厚樸苷A、和厚樸酚及厚樸酚5 項指標的AHP 權重系數分別為0.087、0.054、0.087、0.386、0.386，一致性比例因子（CR）＝0.009＜0.1，表明指標優先比較判斷矩陣一致性較好，權重系數有效，結果見表2。

2.3.3 CRITIC-AHP 復合加權法計算權重 通過CRITIC 和AHP 分別得到各項指標的相關權重，采用復合權重公式ω復合ij＝ωAHPωCRITIC/∑ωAHPωCRITIC計算[18]得到紫丁香苷、木蘭花堿、厚樸苷A、和厚樸酚及厚樸酚5 項指標的復合權重分別為0.025、0.010、0.141、0.344、0.480。式中ωCRITIC表示CRITIC計算的權重系數，ωAHP表示AHP 計算的權重系數。

表2 指標成對比較的判斷優先矩陣Table 2 Priority matrix for comparison on index pairs

2.3.4 綜合評分結果比較 分別采用CRITIC 法、AHP法及CRITIC-AHP復合加權法所得權重系數對試驗結果進行評分，結果見表3。通過相關系數分析，CRITIC 法與AHP 法的相關系數為0.865，CRITIC 法與復合加權法的相關系數為0.998，AHP法與復合加權法的相關系數為0.892，其中CRITIC法與復合加權法的相關性顯著（P＜0.05）。從權重系數分析，CRITIC 法與AHP 法的相關系數為0.369，相關性不顯著（P＞0.05），說明二者所反應的信息不具有疊加性。綜合考慮采用CRITIC-AHP復合加權法。

2.4 BBD-RSM 優選厚樸飲片“發汗”工藝參數

2.4.1 指標成分含量測定結果 以水煮時間（A）、堆積天數（B）、干燥溫度（C）、干燥時間（D）為自變量，厚樸“發汗”前后的5 個質量差異關鍵標志物質量分數的綜合評分為因變量，BBD 試驗設計及結果見表4。根據“2.3.3”項下得到的各指標權重系數，計算綜合評分。

綜合評分＝0.025×紫丁香苷質量分數＋0.010×木蘭花堿質量分數＋0.141×厚樸苷A 質量分數＋0.344×和厚樸酚質量分數＋0.480×厚樸酚質量分數

表3 3 種賦權法綜合評分結果Table 3 Synthetical scores of three weighted coefficient methods

表4 BBD 試驗設計與結果Table 4 Test design and results of BBD

2.4.2 數據處理與分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件對表4 中的數據進行分析，得到水煮時間、堆積天數、干燥溫度、干燥時間與綜合評分之間的二次多元回歸模型方程：Y＝15.90－0.60 A－1.87 B－0.35 C＋0.52 D＋0.45 AB－0.83 AD＋0.95 BC＋0.22 BD＋3.71 A2＋1.99 B2＋0.72 C2＋3.72 D2－1.00 B2C＋2.28 BC2，P＝0.000 6，F＝7.56，表明模型差異有統計學意義；失擬項P＝0.056 7，失擬項不顯著，說明該模型擬合度和可信度均達標，實驗誤差較小，可以用此模型對厚樸“發汗”工藝進分析和預測。方差分析結果見表5。此回歸方程也可以較好的反應出水煮時間、堆積天數、干燥溫度、干燥時間與綜合評分之間的關系，各因素對綜合評分的影響順序為堆積天數（B）＞水煮時間（A）＞干燥時間（D）＞干燥溫度（C）。依據Design-Expert 8.0.6 軟件得到二次回歸方程模型及響應面圖評價試驗因素之間的交互強度，確定最佳炮制工藝參數，結果見圖2。

根據模型擬合結果，預測厚樸飲片最優“發汗”工藝為最佳發汗工藝為水煮2 min，堆積1 d，晾曬7 d 后于45.46 ℃的烘箱中干燥35.97 h，綜合評分為30.161 5。

2.5 “發汗”工藝驗證

取厚樸藥材3 份，按優選的“發汗”工藝進行發汗處理，考慮實際操作，將“發汗”工藝調整為水煮2 min，堆積1 d，晾曬7 d 后45 ℃干燥36 h。按此工藝條件重復3 次，實驗結果見6。紫丁香苷平均質量分數為1.43 mg/g，木蘭花堿平均質量分數為4.58 mg/g，厚樸苷A 平均質量分數為13.15 mg/g，和厚樸酚平均質量分數為25.08 mg/g，厚樸酚平均質量分數為38.91 mg/g，綜合評分平均值為29.244，與預測值（30.161 5）的偏差為3.04%。

表5 方差分析結果Table 5 Analysis of variance

圖2 A、B、C、D 對綜合評分的響應面圖Fig.2 Response surface figure of A,B,C and D to comprehensive score

表6 工藝驗證結果Table 6 Process validation results

3 討論

3.1 厚樸“發汗”前后多指標質量差異成分的確定

“發汗”作為確保厚樸的質量的關鍵一環，歷版《中國藥典》及民間傳統生產都將其作為提升厚樸質量的方法。厚樸“發汗”后其外觀和內在成分都發生顯著變化[3]，本實驗基于此現象進行“發汗”工藝優化。盡管采用不同的工藝參數進行“發汗”，厚樸在“發汗”后內表面都會逐漸變至紫黑發亮（圖3），因此沒有將厚樸“發汗”后的外觀性狀變化納入本實驗的考察指標。

圖3 厚樸“發汗”前后性狀變化Fig.3 Character changes of Magnoliae Officinalis Cortex before and after “sweating”

為了使厚樸“發汗”工藝考察指標選擇更為合理，本實驗基于對有效成分變化[4-5,7,9]、網絡藥理學預測[11]及藥理活性研究[10,12-14]等多個角度的厚樸“發汗”質量變化研究，最終確定厚樸酚、和厚樸酚、紫丁香苷、厚樸苷A、木蘭花堿5 個質量差異關鍵標志物作為“發汗”工藝考察指標。其中厚樸酚與和厚樸酚為木脂素類成分，是厚樸主要活性成分，發揮抗炎、抗菌、抗氧化、調節胃腸運動的作用[9,12]；紫丁香苷和厚樸苷A 為苷類成分，具有抗炎鎮痛，保護胃黏膜損失的作用[19-20]；木蘭花堿作為厚樸中生物堿的代表成分之一，既是厚樸的潛在毒性成分，也是厚樸發揮抗潰瘍作用的內在成分之一[9,11]。

3.2 CRITIC-AHP 復合加權法結合Box-Behnken響應面法優化厚樸“發汗”工藝

實驗在前期預試驗的基礎上，考察了水煮時間、堆積天數、干燥溫度、干燥時間對“發汗”厚樸質量的影響，并篩選相應因素水平。傳統上厚樸“發汗”后是采用曬干的方法，然而曬干的方法藥材水分含量差異大，容易回潮，不利于控制厚樸“發汗”質量，且現代干燥技術廣泛運用于藥材烘干及干燥過程[21-22]，效果與效率明顯優于傳統的自然晾曬，因此，本實驗加入干燥溫度及干燥時間2 項因素[23]。權重系數的設定是厚樸“發汗”工藝優化中需重點考慮的問題，本實驗采用主觀-客觀結合的方式，即采用CRITIC-AHP 復合加權法，吸取2 種類型賦權法的優點，使得到的數據信息更為全面可靠。實驗采用復合加權法確定厚樸“發汗”工藝中各評價指標的權重系數，優選后的“發汗”工藝穩定可行，可為厚樸質量控制提供參考和數據支持。

3.3 厚樸“發汗”過程中成分發生轉變的途徑

文獻研究發現[6,8-9]，堆積時間越久，厚樸主成分厚樸酚、和厚樸酚的含量越高。但本實驗結果發現，厚樸酚及和厚樸酚的含量增加與堆積天數并沒有直接的聯系，兩者的增加是4 項因素交叉作用的結果，且根據灰色關聯度法分析結果，干燥時間及水煮時間對兩者含量的影響更大，推測原因為厚樸“發汗”過程中許多苷類成分水解為糖苷及酚類化合物，長時間在一定溫度下通過桂皮酸途徑[9,24]轉化為木脂素類（厚樸酚、和厚樸酚）。

另有文獻研究表明[8-9,12]，厚樸苷A 的含量在“發汗”后顯著下降。而本實驗發現，堆積天數對厚樸苷A 含量的影響顯著。在堆積1 d 的條件下，厚樸苷A 的含量最高可達到翻倍，即從13.24 mg/g增長至25.87 mg/g，而當堆積4 d 時，厚樸苷A 的含量與“發汗”前接近，堆積7 d 后，其含量明顯下降，最低僅有4.59 mg/g，推測原因為厚樸苷A是含有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚羥基的不穩定結構，極其容易被水解和暫時性合成，在堆積發汗的前幾天，厚樸中其他苷類成分水解得到的苯酚類化合物在相關酶的作用下暫時組合合成厚樸苷A，隨著堆積時間的增加，這種不穩定結構也一并被水解反應[5,19,24]。本實驗運用多指標質量差異關鍵標志物、現代分析技術及響應面法相結合的方式優厚樸“發汗”工藝，量化“發汗”工藝參數，以期為厚樸質量標準的建立提供數據支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突