粗莖秦艽多糖GCP-1的分離純化、結構表征及抗炎活性評價

于少朋，曾 銳，韓 珍，曾元蓮，楊 玲，瞿 燕，秦旭華*

1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137

2.西南民族大學藥學院，四川 成都 610041

秦艽為龍膽科龍膽屬Gentiana(Tourn.) L.秦艽組（Sect.Cruciata Gaudin）多年生草本植物的干燥根，《中國藥典》2020年版規定其法定來源為植物秦艽Gentiana m acrophyllaPall.、麻花秦艽G.stramineaMaxim.、粗莖秦艽G.crassicaulisDuthie ex Burk.或小秦艽G.dahuricaFisch.。其中粗莖秦艽主要分布于四川、貴州、云南、西藏等海拔2700～3800 m 的高山草甸、山坡草地、灌叢及林緣中，為中國西南地區秦艽的代表品種，也是人工種植和市場流通規模較大的品種[1]。秦艽始載于《神農本草經》列為中品，至今已有2000 多年的藥用歷史。秦艽是重要的中藥，也是藏、蒙和彝等多民族用藥，具有祛風濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱的功效，中醫用于治療風濕痹痛、中風半身不遂、筋脈拘攣，黃疸等證[2]。目前認為秦艽的抗炎、抗風濕活性成分主要集中在其環烯醚萜類、黃酮類及三萜類等成分，其他成分研究較少。近年來，多項研究表明中藥多糖同樣具有生物活性，如抗凝血、抗氧化、免疫活性[3-5]等。目前秦艽多糖的研究甚少，主要有陳克克等[6]使用HPLC 測定了秦艽多糖的單糖組成，本課題組前期對粗莖秦艽多糖的提取優化進行了研究，本研究從粗莖秦艽中分離純化制備多糖，運用光譜、色譜以及核磁共振等方法對其結構進行分析，并使用小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7模型評價其抗炎活性，為粗莖秦艽多糖的進一步研究奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

粗莖秦艽采自四川阿壩州黑水縣，經西南民族大學劉圓教授鑒定為粗莖秦艽G.crassicaulisDuthie ex Burk.的根。對照品D-甘露糖（批號140651-201502，質量分數99.4%）、L-鼠李糖（批號111683-201505，質量分數99.8%）、D-葡萄糖醛酸（批號140648-201505，質量分數99.8%）、D-半乳糖醛酸（批號111646-201506，質量分數99.8%）、D-無水葡萄糖（批號110833-201506，質量分數99.9%）、D-半乳糖（批號100226-201506，質量分數99.9%）、L-阿拉伯糖（批號150624-201507，質量分數 99.8%）、葡聚糖標準品（批號 140639-201203），均購自中國食品藥品檢定研究院；CCK-8檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒和白細胞介素-1β（IL-1β）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；碘甲烷（分析純，北京化學試劑公司）；DEAE-52 陰離子樹脂、SephadexG-100 凝膠（上海源葉生物化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純級別。

1.2 儀器

GC-MS-QP2010 型氣質聯用儀（日本Shimadzu公司）；EQUINOX 55 型傅里葉紅外光譜儀（德國Bruker 公司）；Waters 515 液相色譜儀（配置Waters 2410 示差檢測器，Waters 公司）；Agilent1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；水相凝膠色譜柱TSK-GelG4000PWXL（300 mm×7.5 mm，10 μm，日本TOSOH公司）；Bruker AVIII-600 NMR光譜儀（美國Bruker 公司）；Elx808 型酶標儀（Bio-Tek 公司）。

2 方法

2.1 GCP-1 的分離和純化

取干燥粗莖秦艽藥材500 g，切段并打粉，過三號篩，加入10 倍量石油醚脫脂（30～60 ℃，6 h）。干燥后殘留物加 14 倍量水超聲輔助熱水浸提（25 ℃超聲20 min，80 ℃，1.5 h，2 次），提取液經脫脂棉濾過后，合并濾液，55 ℃真空濃縮至總體積的1/3；按4 倍體積加20% Sevage 試劑[二氯甲烷-正丁醇（4∶1）]除去蛋白質，重復幾次，直至無明顯蛋白質為止。濃縮，加入4 倍體積無水乙醇沉淀，4 ℃冷藏12 h，再進行離心（2000 r/min、15 min），然后用丙酮、乙醚洗滌，揮干，即得粗莖秦艽粗多糖。然后將粗多糖過DEAE-52 柱依次用蒸餾水和0.5、1 mol/L NaCl 溶液梯度洗脫，隔管檢測吸光度（A）值（硫酸-苯酚法），收集洗脫的各組分，洗脫得到2 個多糖組分，即水洗脫組分和0.5 mol/L NaCl 溶液洗脫組分。0.5 mol/L NaCl 溶液洗脫組分經SephadexG-100 凝膠色譜柱純化，用0.1 mol/L NaCl 溶液等度洗脫，透析后冷凍干燥得均一多糖GCP-1。

2.2 GCP-1 的總糖含量測定

通過改良的硫酸-苯酚法對總糖含量進行測定。以0.5 mg/mL 葡萄糖溶液為標準液，然后分別量取標準液0、10、20、30、40、50 μL 加雙蒸水補足至100 μL 工作液，向工作液中加6%苯酚溶液200 μL，快速加入濃硫酸1.5 mL，混合均勻。于100 ℃的水浴鍋中加熱10 min，取出冷卻，然后量取200 μL 加入96 孔板中，于490 nm 波長下檢測A值，以對照品葡萄糖質量濃度為橫坐標，A值為縱坐標繪制標準曲線。

2.3 GCP-1 的純度和相對分子質量測定

色譜條件：TSK-GelG4000PWXL 凝膠色譜柱（300 mm×7.5 mm，10 μm），流動相為0.1 mol/L NaNO3溶液，進樣量20 μL，體積流量0.6 mL/min，柱溫與檢測器溫度均為40 ℃。

先將不同相對分子質量的葡聚糖標準品（5.0×104、8.0×104、1.5×105、2.7×105、6.7×105、1.4×106、2×106、5.3×106）配成2 mg/mL 的水溶液，用微孔濾膜（直徑50 mm、孔徑0.45 mL）濾過后進樣，然后將樣品配成2 mg/mL 的水溶液，過微孔濾膜（直徑50 mm、孔徑0.45 mL）后進樣，測定樣品的保留時間，以相對分子質量對數為縱坐標，以對保留時間為橫坐標繪制標準曲線，根據線性回歸方程計算樣品相對分子質量。

2.4 GCP-1 的單糖組成分析

取2 mg GCP-1，加入3 mL 2 mol/L 三氟乙酸（TFA），密封，110 ℃水解6 h。加等體積的甲醇于水解產物中，并在減壓情況下旋轉蒸發干燥，重復上述過程幾次以除去過量的TFA。取全水解液100μL，堿性條件下進行PMP 衍生化，衍生后除去多余的PMP，進行HPLC 分析。

色譜條件：采用Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；檢測器為紫外檢測器；進樣量為10 μL；在245 nm 檢測波長下，檢測溫度為35 ℃，以0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）-乙腈（83∶17）為流動相，按體積流量1 mL/min 進行檢測。

服務器：云服務器,Windows2008Server 服務器系統和Apache為平臺，MYSQL數據庫系統。

2.5 GCP-1 的紅外光譜（IR）分析

稱取干燥的GCP-1 樣品約3.0 mg，與適量干燥的KBr 粉末置于瑪瑙研缽中研磨均勻，壓片，在4000～400 cm-1的范圍內進行IR 掃描。

2.6 GCP-1 的甲基化分析

2.6.1 甲基化實驗 稱取GCP-1 樣品約10 mg，通過碳二亞胺方法[7]將GCP-1 羧基還原，通過IR 確定羧基還原程度；根據文獻方法[8]，完全還原后的GCP-1 進行甲基化，通過IR 確定甲基化程度，甲基化完成后，進行酸水解和乙酰化衍生，采用氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）進行分析。

2.6.2 質譜條件 連接處溫度250 ℃；EI 離子源，電子能量70 eV，離子溫度230 ℃；DB-5 石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），體積流量1 mL/min；升溫程序為120 ℃保持3 min，然后在8 ℃/min 至250 ℃的溫度下保持10 min；進樣量1 μL。

2.7 GCP-1 的核磁分析

GCP-1（30 mg）溶解在1 mL D2O 中，并在25 ℃的Bruker AVIII-600 NMR 光譜儀上進行1H-NMR、13C-NMR、1H-13C HSQC 分析。

2.8 GCP-1 對小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 的抗炎活性的影響

2.8.1 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 的增殖實驗將指數生長期的小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7 以4.8×105個/孔的密度接種在96 孔板中。加入不同質量濃度（10、50、100、200 μg/mL）GCP-1，每個樣品質量濃度設置3 個平行組。參考文獻方法[9]，進行CCK-8 實驗，通過酶標儀在570 nm 的波長下測量每組的A值，以細胞培養液處理細胞作為對照組，按公式計算細胞活力。

細胞活力=A570實驗/A570對照

2.8.2 ELISA 法檢測IL-1β、NO 和TNF-α 的水平將小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7（1×105個/孔）接種到24 孔板中，用脂多糖（LPS）1 μg/mL 處理1 h后，加入不同質量濃度（10、50、100、200 μg/mL）的GCP-1。24 h 后，收集培養上清液。每個樣品質量濃度設置3 個平行組，同時以細胞培養液處理細胞作為對照組。根據試劑盒說明書操作，用酶標儀在540 nm 的波長下測量每組的A值。根據A值，通過測定得到的標準曲線計算細胞培養上清液中抗炎因子TNF-α、IL-1β 和NO 水平。

2.8.3 統計學處理 實驗結果以±s表示，應用SPSS 21.0 進行數據處理，數據的差異統計分析均采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。

3 結果與分析

3.1 粗莖秦艽多糖的分離純化

通過超聲輔助熱水浸提法提取，進行脫蛋白，濃縮，無水乙醇沉淀，然后用丙酮、乙醚洗滌，揮干，得粗莖秦艽粗多糖，得率為4.32%；粗多糖經DEAE-cellulose 柱色譜分離得到2 個組分：水洗脫組分、0.5 mol/L NaCl 洗脫組分，見圖1。因水洗脫組分含量相對較少，故將0.5 mol/L NaCl 洗脫組分通過SephadexG-100 柱進一步純化，得GCP-1，得率為3.48%。硫酸-苯酚法測得GCP-1 總糖質量分數為84.38%。如圖2 所示，凝膠色譜法測定GCP-1 相對分子質量為6.87×104。GCP-1 的峰單一且對稱，表明其純度高且結構均勻，可用于后續的結構分析。

圖1 粗莖秦艽粗多糖經DEAE-cellulose 柱的分離圖Fig.1 Elution cruve of G.crassicaulis crude polysaccharide on DEAE-cellulose column

圖2 GCP-1 高效凝膠色譜Fig.2 HPGPC of GCP-1

3.2 GCP-1 的結構解析

3.2.1 GCP-1 的單糖組成 如圖3 所示，GCP-1 由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖7 種單糖組成，其物質的量比為0.07∶3.07∶0.42∶1.98∶1.33∶5.22∶6.76。

圖3 混合對照品溶液 (A) 和GCP-1 的單糖組成 (B) 的HPLC 分析Fig.3 Monosaccharide composition analysis of mixed standard and GCP-1 by HPLC

圖4 GCP-1 的紅外光譜分析Fig.4 FT-IR characterization of GCP-1

3.2.2 GCP-1 的紅外光譜分析 GCP-1 的IR 光譜中，具有多糖的典型吸收帶（圖4）。在3600～3200 cm-1、3000～2800 cm-1處出現特征吸收峰[10]。GCP-1 在3398 cm-1處有一強而寬的吸收峰，該峰是由于羥基的伸縮振動形成，說明存在分子內、分子間氫鍵。2929 cm-1處是一弱的吸收峰，由C-H的伸縮振動造成[10]。1742 和1612 cm-1處的吸收峰由酯羰基（COOR）和羧酸酯（COO-）伸縮振動造成[11-12]，表明GCP-1 是酸性多糖。GCP-1 在1541 cm-1處沒有吸收峰，表明它不含蛋白質[13]。

3.2.3 GCP-1 的甲基化分析 GCP-1 經過脫羧基、甲基化、酸水解以及乙酰化之后進行GC-MS 分析，結果見表1。因為甘露糖和葡萄糖酸的含量低于甲基化分析方法檢測限度，因此信號不明顯。

3.2.4 GCP-1 的核磁分析 →2)-α-L-Rhap(1→和→2,4)-α-L-Rhap-(1→殘基的確定：13C-NMR 譜（圖5）中δ16.5 處的化學位移和1H-NMR 譜（圖6）中δ1.24和1.16 處化學位移，以及HSQC 譜（圖7）上δ16.8/1.22和16.6/1.16處的化學位移對應于α-L-Rhap的C-6/H-6，結合甲基化分析結果可知，GCP-1 含有→2)-α-L-Rhap(1→和→2,4)-α-L-Rhap-(1→殘基[14-15]；結合文獻可知，→2)-α-L-Rhap(1→和→2,4)-α-LRhap-(1→殘基表示GCP-1存在I型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖（RGI）區域[16]。

表1 GCP-1 的甲基化分析結果Table 1 Analysis of GCP-1 methylation

圖5 GCP-1 的1H-NMR 譜Fig.5 1H-NMR spectrum of GCP-1

→4)-α-D-GalpA-(1→殘基的確定：δ100.2/4.87，68.0/3.64，68.5/3.92，78.6/4.38，70.5/5.06 處的化學位移（圖5、6）分別對應于→4)-α-D-GalpA-(1→的C-1/H-1、C-2/H-2、C-3/H-3、C-4/H-4，C-5/H-5[15]。結合文獻可知，GCP-1 存在高半乳糖醛酸聚糖（HG）區域；在13C-NMR 譜（圖5）中，→4)-α-D-GalpA-(1→殘基酯化和未酯化C-1 的化學位移分別為δ100.0和99.4，對應C-6 處化學位移分別為δ170.6 和175.1，分別來自甲酯的羰基碳和羧基碳；酯化的甲基碳在δ52.8 處有信號[17-18]。HSQC 譜（圖7）上化學位移δ20.5/2.09 和20.4/2.01 是典型乙酰基基團的信號[19]。綜上可知，GCP-1 存在高半乳糖醛酸聚糖（HG），并且殘基→4)-α-D-GalpA-(1→被部分甲基化和乙酰化。

α-L-Araf 基團的確定：13C-NMR 譜（圖5）中δ106.3,106.8,107.4 處的化學位移均為α-L-Araf 基團的信號，結合HSQC 譜（圖7）可知，δ106.8/5.16和106.8/5.07 處的化學位移分別對應于→3,5)-α-LAraf-(1→和→5)-α-L-Araf-(1→的C-1/H-1[17-18]，→3,5)-α-L-Araf-(1→和→5)-α-L-Araf-(1→的大量存在表明GCP-1 存在阿拉伯聚糖[18,20-22]。

β-D-Galp 基團的確定：13C-NMR 譜（圖5）中δ104.3 (C-1),77.6 (取代的C-4),74.4 (C-5),73.6(C-3),71.8 (C-2) 和61.0 (C-6) 處的化學位移以及HSQC 譜（圖7）上δ102.7/4.42、103.9/4.56 和103.3/4.36 處的化學位移均屬于β-D-Galp 基團，結合甲基化結果可知，大量的β-D-Galp 的存在表明GCP-1 存在I 型阿拉伯半乳聚糖（AGI）和II 型阿拉伯半乳聚糖（AG II），通常存在于側鏈中[18,20-22]。

圖6 GCP-1 的13C-NMR 譜Fig.6 13C-NMR spectrum of GCP-1

圖7 GCP-1 的1H-13C HSQC 譜Fig.7 1H-13C HSQC spectrum of GCP-1

綜上可知，GCP-1 是一種典型的果膠多糖，含有HG 和RG I 區域及AG I 和AG II 側鏈。在碳譜中，δ100.0 和99.4 處為→4)-α-D-GalpA-(1→酯化和未酯化C-1 的化學信號值，對應C-6 處化學位移分別為δ170.6 和175.1，酯化羰基的甲基碳在52.8 處有信號，C-2～5 信號化學位移值依次為68.0、68.5、78.6、70.5；這些光譜數據表明存在甲基酯化的HG[17]。Vincken 等[16]研究發現HG 可能作為RGI的側鏈存在。結合單糖分析中GalpA 含量不是很高，因此推測此多糖含有HG 區域，且可能作為RGI 的側鏈存在。

3.3 GCP-1 對小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 細胞增殖及分泌IL-1β、NO 和TNF-α 的影響

由圖8 可知，GCP-1 對小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 作用24 h 后，與對照組相比，GCP-1 在質量濃度為10、50、100、200 μg/mL 時均可顯著促進小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 細胞的增殖（P＜0.01）。

由圖9 可知，與對照組相比，LPS 能顯著增加IL-1β、NO 和TNF-α 的產生；由圖9-c 可知，與LPS組相比，GCP-1在質量濃度為10、50、100、200 μg/mL時均可顯著抑制NO 的產生；如圖9-a、b，隨著GCP-1 質量濃度的增大，對TNF-α 和IL-1β 的產生抑制越大；在GCP-1 質量濃度為200 μg/mL 時對IL-1β、NO 和TNF-α 的抑制作用最大；說明GCP-1通過抑制細胞因子IL-1β、NO 和TNF-α 的產生發揮抗炎功能。

圖8 GCP-1 對RAW264.7 細胞的增殖活性 (±s,n=3)Fig.8 Effects of GCP-1 on proliferation of RAW264.7 cells(±s,n=3)

4 討論

GCP-1 經HPGPC 譜圖分析為均一性多糖，其相對分子質量為6.87×104；由單糖分析表明GCP-1由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖7 種單糖組成，其物質的量比依次為0.07∶3.07∶0.42∶1.98∶1.33∶5.22∶6.76；其中半乳糖醛酸、葡萄糖和阿拉伯糖含量比較高，甘露糖和葡萄糖醛酸含量較少；而同時GC-MS 和NMR 檢測發現其含有由殘基→4)-α-DGalpA-(1→構成的HG 區域，但單糖分析中GalpA含量不是很高，推測是該多糖RGI 的側鏈可能含有HG；其同時含有由α-L-Araf 和β-D-Galp 基團組成的阿拉伯聚糖、AG I 和AG II 區域；這些都是典型的果膠多糖所具有的結構。通過體外細胞實驗表明GCP-1 能明顯增強RAW264.7 細胞的增殖，并能抑制RAW264.7 細胞TNF-α、IL-1β 和NO 的產生，呈現顯著的抗炎活性。

圖9 GCP-1 對RAW264.7 細胞釋放TNF-α (a)、IL-1β (b) 和NO (c) 的影響 (±s,n=3)Fig.9 Effects of GCP-1 on TNF-α (a),IL-1β (b),and NO (c) of RAW264.7 cells (±s,n=3)

GCP-1 結構和抗炎活性的探討，對于深入研究粗莖秦艽抗炎作用的物質基礎具有重要意義。對中藥均一多糖結構的研究，可為以多糖為主要成分的中藥質量控制水平的提升奠定基礎，避免現代標準中多采用的總多糖測定方法存在的抗干擾能力弱的問題。

利益沖突所有作者聲明不存在利益沖突