神經(jīng)肽FF 在小黃魚(Larimichthys polyactis)性腺發(fā)育早期的表達與定位分析*

肖 燃 宋長普 朱 陽 黃 偉 鄭利兵 遲長鳳① 樓 寶

(1. 浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 海洋生物種質(zhì)發(fā)掘與利用國家地方聯(lián)合實驗室舟山 316022; 2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究所 杭州 310021)

神經(jīng)肽 FF(Neuropeptide FF, FLFQPQRFa-NH2,NPFF)是一種類酰胺化神經(jīng)肽, 屬于 RF 氨基肽家族(Fukusumi et al, 2006)。神經(jīng)肽FF 與促性腺激素抑制激素(GnIH)同源, 具有豐富的生理活性, 在調(diào)節(jié)應(yīng)激對生殖的影響(Ubuka et al, 2018)、性成熟(Shahjahan et al, 2015)、調(diào)節(jié)血壓(Allard et al, 1995)、體液平衡(Majane et al, 1991; Kalliom?ki et al, 2004)、體溫(Moulédous et al, 2010)、消化道運動(Decker et al,1997)、抗炎(Yang et al, 2003)、心血管功能(Laguzzi et al, 1996)、脂肪細胞分化(Lefrère et al, 2002)和內(nèi)分泌(Jhamandas et al, 2013)等方面發(fā)揮著重要作用。

小黃魚(Larimichthys polyactis)又名小黃花, 屬于石首魚科(Sciaenidae)黃魚屬(Larimichthys), 與帶魚(Trichiurus lepturus) 、 曼 氏 無 針 烏 賊 (Sepiella japonica)、大黃魚(Larimichthys crocea)同被譽為東?！八拇蠛．a(chǎn)”之一(Park et al, 2019)。目前各國學(xué)者研究主要集中在小黃魚的資源分布等方面, 但對小黃魚生殖調(diào)控的研究還相對較少(蒙子寧等, 2003; Wang et al, 2009)。由于過度捕撈、環(huán)境污染、氣候環(huán)境變化等原因, 小黃魚捕撈量急劇下降, 捕獲的小黃魚表現(xiàn)出日趨小型化、性成熟等現(xiàn)象, 種質(zhì)資源退化嚴(yán)重,已經(jīng)無法滿足人們的消費需求(Chen et al, 1997; 嚴(yán)利平等, 2014)。目前已有學(xué)者對小黃魚生殖周期、精液特性和精子結(jié)構(gòu)等進行了研究(Lim et al, 2010; Le et al, 2011)。Wang 進一步通過實驗發(fā)現(xiàn)KIF3A 可能在精子發(fā)生過程中參與核重塑和尾巴形成(Wang et al,2019), 但關(guān)于小黃魚在生殖方面的研究十分有限。研究表明促性腺激素能與腦垂體生長激素受體相互作用, 說明神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)能影響魚類生長及性腺的發(fā)育(林浩然, 2000), 而神經(jīng)肽FF 能同時調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和性腺發(fā)育。因此, 本實驗開展神經(jīng)肽 FF 在小黃魚性腺發(fā)育過程中的潛在功能研究, 分析神經(jīng)肽FF 基因在性腺發(fā)育早期的表達與定位, 為開展神經(jīng)肽FF 的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 小黃魚樣品采自浙江省寧波市象山港水產(chǎn)育種有限公司。選取健康有活力的第Ⅱ期小黃魚[體長為(11±2) cm, 體重為(16±2) g], 取出腦、頭腎、心、鰓、皮膚、性腺、脾臟、肝臟、胃、肌肉、腸道等組織(n=3), 立即在室溫下 RNA 保存液浸泡1 h, 液氮中保存24 h, 然后轉(zhuǎn)移至-80°C 冰箱中, 直至提取總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 備用。腦、性腺(卵巢)放在預(yù)冷的4%多聚甲醛中固定, 用冰袋運回實驗室, 4°C 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實驗試劑 RNA 保存液、RNAiso Plus、Ex Taq Mix、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 均購于TaKaRa 公司、Riboprobe?Combination System-試劑盒購于 Promega科技有限公司、DIG RNA Labeling Mix、Anti-Digoxigenin-AP conjugate、BCIP/NBT 顯色試劑盒均購于 Roche 科技有限公司、Anti-FMRFamide 購于ImmuoStar 公司、SABC 試劑盒購于上海生物工程股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小黃魚神經(jīng)肽FF 基因組織表達特異性分析采用M-MLVRTase cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 第一條鏈, -20°C 冰箱備用。選取小黃魚 β-actin、18S 基因作為內(nèi)參, 通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 分析小黃魚神經(jīng)肽 FF 基因在不同組織中表達的差異性。根據(jù)所得神經(jīng)肽FF 基因cDNA全長, 設(shè)計其 qRT-PCR 特異性引物, 引物序列見表1。選擇第Ⅱ期性未成熟的小黃魚三只做3 次生物學(xué)重復(fù), 每次反應(yīng)做3 次機械重復(fù)。qRT-PCR 實驗操作參考SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)試劑說明書進行。qRT-PCR 結(jié)果以2-ΔΔCT方法換算成相對表達量, 單因素方差分析分析(One-way ANOVA)運用軟件 SPSS 17.0 來實現(xiàn), 顯著性差異分析則通過SPSS17.0 的 Duncan 法得出, P＜0.05 為顯著差異; 利用Origin 8.1 軟件進行柱狀圖繪圖。

表1 小黃魚神經(jīng)肽FF 基因熒光定量引物Tab.1 Primers of LpNPFF used in real-time PCR

1.2.2 小黃魚神經(jīng)肽FF 基因在腦和卵巢中的定位分析 在小黃魚神經(jīng)肽FF 基因的ORF 區(qū)內(nèi)設(shè)計原位雜交探針的引物, 反義探針(用A 表示)需在下游引物前加上T7 啟動子序列, 正義探針(用S 表示)需在上游引物前加上T7 啟動子序列, 引物序列參見表2。探針根 據(jù) Riboprobe?CombinationSystem-SP6/T7 RNA Polymerase 試劑盒以及DIG RNA Labeling Mix 說明書進行操作。在雜交前對組織切片進行脫蠟、復(fù)水、通透處理, 并且在預(yù)雜交液中孵育 1 h (42°C); 暗盒中 50°C 雜交過夜; 滴加二抗(抗地高辛-AP 抗體, 稀釋1∶2000), 室溫暗盒中靜置3 h; BCIP/NBT 染色封片后顯微觀察。

表2 LpNPFF 基因原位雜交引物Tab.2 Primers used in LpNPFF in situ hybridization

1.2.3 FaRPs 成熟肽在小黃魚腦和卵巢中的定位分析 通過間接免疫過氧化物酶方法處理切片:將組織去石蠟、復(fù)水, 然后在pH 7.4 的0.1 mol/L PBS 中洗滌; 切片用0.3% H2O2處理以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。與胎牛血清孵育 20 min 后, 切片在 4°C 下與兔FMRFamide 多克隆抗體(1∶2000 稀釋)在濕盒中孵育過夜(陰性對照以PBS 代替一抗); 將切片在PBS 中沖洗數(shù)次, 并在室溫下與二抗(生物素標(biāo)記羊抗兔 IgG)在PBS 中按1∶1000 稀釋孵育30 min。在PBS 中漂洗兩次后, 將抗生物素蛋白-過氧化物酶-偶聯(lián)物溶液加入到載玻片中, 并在37°C 下孵育30 min。最后, 通過使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)可視化反應(yīng)產(chǎn)物, 并用蘇木精染色細胞核。然后將切片洗滌、脫水、透明, 使用中性樹脂封片, 顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 小黃魚神經(jīng)肽FF 基因組織表達特異性分析

以第Ⅱ期的小黃魚各個組織為模板進行qRT-PCR 熒光定量分析LpNPFF 組織差異性情況。如圖 1 所示, LpNPFF 在所有測試的組織中均有表達,包括腦、腎、性腺、頭腎、心臟、肝臟、胃、脾臟、鰓、腸和肌肉。其中, LpNPFF 基因在腦組織中高表達, 并且與其他組織比較具有顯著性差異。性腺、肌肉和脾臟LpNPFF 表達略高于其他外周組織, 在胃、鰓、腸道中LpNPFF 的表達相對較少。

圖1 LpNPFF 基因在小黃魚不同組織中的相對表達水平Fig.1 Relative expression levels of the LpNPFF genes in different tissues of L. polyactis

2.2 LpNPFF在小黃魚腦和卵巢中mRNA的定位分析

基于LpNPFF 基因mRNA 的相對表達, 我們選取小黃魚腦 (端腦、中腦、小腦及延腦)和性腺進行原位雜交實驗。實驗結(jié)果表明, 在小黃魚端腦(圖2b, 2c,2d, 2e, 2f)、中腦(圖3b, 3c, 3d), 小腦及延腦(圖4b, 4c,4d)組織中能夠清晰觀察到LpNPFF 基因mRNA 的陽性雜交信號, 用正義探針進行對照實驗雜交則不能觀察到信號(端腦, 圖 2a; 中腦, 圖 3a; 小腦及延腦,圖4a)。小黃魚LpNPFF 的mRNA 主要分布于小黃魚的中腦(視葉)以及延腦, 端腦和小腦部分的表達較少。在中腦的視頂蓋(OTec)、圓環(huán)體(TL)、結(jié)節(jié)前核(NAT)、外側(cè)結(jié)節(jié)核(NLT)、下丘腦彌散核(NDLI)以及延腦(MO)中檢測到大量表達LpNPFF mRNA 的細胞,這可能暗指LpNPFF 調(diào)控著不同的生理學(xué)功能。并且在小黃魚未成熟的性腺組織中也能觀察到明顯的陽性信號(圖5b)。經(jīng)小黃魚性腺組織解剖學(xué)分析, 此時期性腺為卵巢, 以不規(guī)則多角形的稚齡時相的卵母細胞為主要組成部分, 它們之間彼此緊密相連, 核很大, 呈圓形, 核仁可見分布在核的周圍。因此在細胞質(zhì)與核仁部分能觀察到明顯的 LpNPFF 基因 mRNA的陽性雜交信號。

2.3 FaRPs 成熟肽在小黃魚腦和卵巢中的定位分析

免疫組化實驗結(jié)果表明, 小黃魚腦組織中的FaRPs 的免疫活性的區(qū)域為棕色(圖6b, 6c, 6d), 與不具 FaRPs 免疫活性的細胞核區(qū)域形成鮮明的對比(圖6a), 我們在中腦的表層發(fā)現(xiàn)了明顯密集的 FaRPs 免疫信號, 而在內(nèi)部則相對較少。在小黃魚性腺組織中,FaRPs 的免疫活性的區(qū)域為棕色(圖7b, 7c, 7d), 與不具 FaRPs 免疫活性的細胞核區(qū)域形成鮮明的對比(圖7a), 并且 RFamide 主要存在于細胞壁壁或結(jié)締組織周圍。我們預(yù)測 LpNPFF 肽作用于性腺壁表層細胞,可能參與調(diào)控性腺發(fā)育等。

3 討論

小黃魚是我國浙江舟山沿海地區(qū)的一種主要的經(jīng)濟性物種, 由于其肉質(zhì)鮮美, 深受人們的喜愛。LpNPFF 是 RFamide 相關(guān)肽家族中的一員, 在許多生物學(xué)過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。實時熒光定量分析顯示, 小黃魚神經(jīng)肽 FF mRNA 在所有被測組織中均廣泛表達, 其中以腦、性腺、腎臟及周圍組織肌肉中表達量最高。在花鱸(Lateolabrax maculatus)(Li et al,2019)和星點東方鲀(Takifugu niphobles)(Shahjahan et al, 2015)中, NPFF 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)和性腺中的表達量最高, 提示LpNPFF 可能在腦和性腺中發(fā)揮重要作用, 這與我們得到的結(jié)果一致。在大鼠(Mus musculus)中, NPFF mRNA 的最高水平出現(xiàn)在脊髓、垂體和下丘腦(Kivipelto et al, 1991; Majane et al, 1993); 而在人類中, NPFF mRNA 的最高水平出現(xiàn)在髓質(zhì)和脊髓(Nystedt et al, 2002), 這有可能說明不同的表達模式表明不同物種大腦功能的差異性。

圖2 LpNPFF 基因mRNA 端腦原位雜交圖Fig.2 Localization of LpNPFF mRNA in telencephalon of L. polyactis

圖3 LpNPFF 基因mRNA 中腦原位雜交圖Fig.3 Localization of LpNPFF mRNA in midbrain of L. polyactis

圖4 LpNPFF 基因mRNA 小腦及延腦原位雜交圖Fig.4 Localization of LpNPFF mRNA in cerebellum and medulla oblongata (MO) of L. polyactis

圖5 LpNPFF 基因mRNA 性腺原位雜交圖Fig.5 Localization of LpNPFF mRNA in gonad of L. polyactis

圖6 小黃魚腦組織中的FaRPs 分布圖Fig.6 Distribution of FaRPs in brain tissue of L. polyactis

圖7 小黃性腺組織中的FaRPs 分布圖Fig.7 Distribution of FaRPs in the gonad tissue of L. polyactis

NPFF 在人(Homo sapiens)和大鼠的細胞定位在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多區(qū)域被檢測到。人類NPFF 基因mRNA 定位于大腦和脊髓(Vilim et al, 1999)。在大鼠中 NPFF 基因 mRNA 高表達于下丘腦室旁核(PVN),這是一個對神經(jīng)激素分泌和交感神經(jīng)流出調(diào)節(jié)至關(guān)重要的自主核(Jhamandas et al, 2006)。與人類和大鼠不同, 在成熟斑馬魚(Danio rerio)和胚胎中確定了表達 NPFF 基因 mRNA 的細胞的定位。在端腦的嗅球和嗅視神經(jīng)核中發(fā)現(xiàn)了ZfPQRF 神經(jīng)元表達, 而在下丘腦、腦干和脊髓中則沒有 ZfPQRF 神經(jīng)元表達(Oehlmann et al, 2002)。這些基因在哺乳動物和硬骨魚之間的差異定位顯示了不同的基因功能。然而, 在我們的研究中, 小黃魚NPFF 基因mRNA 在端腦及小腦部分表達量有限, 但在中腦部分區(qū)域和延腦(MO)區(qū)域有大量表達, 這可能表示LpNPFF 通過不同的途徑向不同組織傳遞信號并且行使著不同的生理學(xué)功能, 其中包括與生殖相關(guān)的 NDLI(Kitahashi et al,2009), 與攝食調(diào)節(jié)相關(guān)的NAT、NLT (Cerdá-Reverter et al, 2000, 2003; Shiraishi et al, 2000)。LpNPFF 基因mRNA 在中腦的分布主要在組織的邊緣, 并且較為集中且呈長條狀分布, 如 OTec 和 NLT 等。NPFF 很可能作為傳遞信號的途徑, 通過不同的途徑向不同組織傳遞信號。根據(jù)最近的研究, 在花鱸中發(fā)現(xiàn)NPFF 及其受體均位于下丘腦, 說明 NPFF 對下丘腦神經(jīng)元有直接的調(diào)節(jié)進食作用(Bechtold et al, 2007;Li et al, 2019)。小黃魚神經(jīng)肽FaRPs 的免疫陽性信號主要集中于腦部細胞表層和卵巢壁細胞表層, 這與原位雜交結(jié)果中 LpNPFF mRNA 的分布較為集中不同。鑒于原位雜交技術(shù)定位的是LpNPFF 的 mRNA,基本可以判定有信號區(qū)域是可能分泌 FaRPs 蛋白的細胞。在胚胎斑馬魚中(Pinelli et al, 2000)和鱒魚(Salmo trutta fario)(Castro et al, 2001)的早期發(fā)育階段也發(fā)現(xiàn)了FMRFamide 類免疫反應(yīng)神經(jīng)元。我們提出一個假設(shè): 腦部組織是小黃魚 RFamide 神經(jīng)肽的來源, 由腦部組織細胞分泌的RFa 神經(jīng)肽通過神經(jīng)纖維向下游傳遞。我們的免疫組織化學(xué)實驗證實, 小黃魚腦部細胞分泌的 RFamide 可能通過內(nèi)外細胞顆粒層和結(jié)締組織向下游傳遞。這說明小黃魚腦組織中的NPFF 是由特定的細胞進行轉(zhuǎn)錄翻譯, 但在翻譯成熟之后, NPFF 蛋白將轉(zhuǎn)運至不同的區(qū)域發(fā)揮作用或進行免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。而在小黃魚卵巢中, 我們發(fā)現(xiàn) FaRPs蛋白的分布較為緊密, 與腦組織中的彌散分布有一定的差異。同時卵巢組織中FaRPs 蛋白主要存在于結(jié)締組織中, 這說明LpNPFF 可能將信號傳遞給性腺組織,但 LpNPFF 蛋白并沒有進入到細胞里面, 僅僅是充當(dāng)一種信號傳遞的中間媒介。因此, 這些神經(jīng)元群可能表達其他的 RFamide, 與已知的 FMRF 抗體的廣泛反應(yīng)性一致(Pinelli et al, 2000)。不同組織中NPFF 的不同分布情況預(yù)示著該蛋白具有不同的生物學(xué)功能,NPFF 除生殖調(diào)控之外, 可能作為一個神經(jīng)調(diào)質(zhì)調(diào)解小黃魚的更高級的生理活動, 例如攝食、免疫等。

4 結(jié)論

組織特異性分析結(jié)果顯示小黃魚神經(jīng)肽FF 基因在腦和性腺中表達含量較高, 肌肉和脾臟次之。原位雜交實驗結(jié)果顯示, LpNPFF mRNA 主要分布于小黃魚的中腦(視葉)以及延腦, 端腦和小腦部分的表達較少。在中腦的視頂蓋(OTec)、圓環(huán)體(TL)、結(jié)節(jié)前核(NAT)、外側(cè)結(jié)節(jié)核(NLT)、下丘腦彌散核(NDLI)以及延腦(MO)中檢測到大量表達LpNPFF mRNA 的細胞,這可能與LpNPFF 調(diào)控著不同的生理學(xué)功能有關(guān)。并且在第Ⅱ期的卵巢細胞中也能觀察到明顯的陽性信號。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示, 小黃魚神經(jīng)肽FaRPs 的免疫陽性信號主要集中于腦部細胞表層和卵巢壁細胞表層, 這與原位雜交的結(jié)果中LpNPFF 基因mRNA的分布形成呼應(yīng)。