干血點技術(shù)在反興奮劑領(lǐng)域的應(yīng)用研究與前景展望

荊京，單圓鴻，陳佩杰，徐昕

（上海體育學(xué)院國家興奮劑檢測上海實驗室（籌），上海200438）

世界反興奮劑機構(gòu)（WADA）公布的禁用清單一直在不斷更新，每年都會增加新的禁用物質(zhì)，興奮劑檢測工作時刻面臨著新的挑戰(zhàn)。新型興奮劑往往使用劑量較低，或結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性代謝物極其相似，檢測難度較大。液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有去干擾能力強、分析結(jié)果準(zhǔn)確、檢測靈敏度高、可實現(xiàn)高通量檢測等優(yōu)點，適用于大部分禁用物質(zhì)的檢測，已成為興奮劑檢測的主要方法之一。

在傳統(tǒng)的興奮劑監(jiān)控程序中，運動員的血液或尿液樣本均以液體的形式進行運輸和儲存，面對液體樣本的采集與運輸成本居高不下，長期保存的穩(wěn)定性又難以控制等問題，干血點（dried blood spot，DBS）技術(shù)作為一種更具優(yōu)勢的樣本采集與保存方法受到了越來越多的關(guān)注。DBS技術(shù)可將微量血樣保存在濾紙上，干燥后用于疾病篩查和檢測研究［1］。早在1963年就報道了DBS采樣方法的首次應(yīng)用，從腳跟采集微量血樣用于診斷新生兒苯丙酮尿癥［2］。之后，該方法得到了進一步應(yīng)用，尤其是在新生兒代謝異常篩查中［3-4］。在過去的幾十年里，液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的DBS分析方法逐步建立并發(fā)展，廣泛應(yīng)用于疾病（如癌癥、糖尿病等）監(jiān)測、臨床前藥物開發(fā)、毒理學(xué)和藥代動力學(xué)研究、治療藥物監(jiān)測和代謝組學(xué)分析等各個領(lǐng)域［5-7］。

近年來，DBS與液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用在興奮劑檢測領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注和研究。在2019年世界反興奮劑大會上，國際奧委會主席巴赫提出，反興奮劑實踐不斷對檢測技術(shù)提出更高要求，要大力支持創(chuàng)新型興奮劑檢查和檢測方法的研究與開發(fā)，并著重指出“DBS技術(shù)將有機會使反興奮劑工作產(chǎn)生革命性的劇變”［8］。WADA與世界各地的反興奮劑組織合作，積極推進DBS技術(shù)的開展和實施，以期應(yīng)用于即將到來的2020年東京奧運會和2022年北京冬奧會的興奮劑檢測［9］。筆者簡述了DBS采樣技術(shù)及其在樣本采集、運輸、保存、樣本穩(wěn)定性等方面的優(yōu)勢，探討了DBS采樣技術(shù)在興奮劑檢測領(lǐng)域的現(xiàn)狀和應(yīng)用前景，為DBS采樣技術(shù)在反興奮劑檢測領(lǐng)域的進一步研究和應(yīng)用提供參考。

1 DBS采樣技術(shù)及其優(yōu)勢

DBS采樣技術(shù)是一種將全血樣品收集在卡紙上的采樣技術(shù)。全血滴加在濾紙片上，經(jīng)干燥后得到干血斑塊，再經(jīng)過溶劑萃取后，通過串聯(lián)質(zhì)譜等方法對干血斑中的待檢測組分進行檢測分析［1］。采樣卡通過適宜的化學(xué)試劑處理后，具備溶解細(xì)胞、使蛋白變性、抑制細(xì)菌等其他微生物生長的功能。DBS樣本只需經(jīng)過室溫干燥，不需要任何其他處理，從化學(xué)原理上講，即分析物與血液成分吸附在固體纖維素基質(zhì)上［1］。與傳統(tǒng)靜脈采血相比，DBS采樣簡便、量少且具有微創(chuàng)性［10］，其他的優(yōu)勢還包括樣本的保存和運輸簡易化、室溫下樣本較高的穩(wěn)定性、樣本采集過程中的可控性以及實現(xiàn)樣本處理自動化的可能性等［11-12］。

1.1 樣本的采集

全血采樣通常通過靜脈穿刺獲得樣本，采集方法較復(fù)雜，且需要大量血液以獲取分析檢測所需的足量血漿，并要求專門的醫(yī)學(xué)技術(shù)人員進行采樣，對采樣環(huán)境和采樣人員的要求較高。尿液樣本的收集也較為復(fù)雜，較容易被污染，可能出現(xiàn)尿樣偽造、操縱等情況［13］，并且尿液樣本檢測結(jié)果易受樣本采集時間的影響，受尿液pH值的影響，同時運動員個體間的代謝差異也比較大［14］；而DBS采樣技術(shù)通常可采用指尖穿刺的方式獲得全血樣本，采血量小，通常為20μL［15］，可直接將指尖血液滴到采樣卡上制備DBS樣本。因此，DBS的樣本采集，不易受采樣地點、時間以及采樣人員的限制。DBS采樣不必要求專業(yè)的醫(yī)學(xué)技術(shù)人員，非醫(yī)學(xué)專業(yè)的培訓(xùn)人員也可進行有效采樣，也適用于其他非專業(yè)人員的自我取樣等，為大規(guī)模樣本的采集提供了可能［16-17］。另外，相對于傳統(tǒng)的血液樣本采集，DBS采樣雖仍有刺痛，但采血量少且整個過程具有微創(chuàng)性，特別是對于需要多次采集血樣的運動員，該采樣方式有更好的耐受性，可減輕血液采集帶給運動員的痛苦，并減少因多次采血造成的心理壓力。

在過去的幾年中，已經(jīng)開發(fā)了幾種不同于傳統(tǒng)DBS采樣 技 術(shù)的設(shè)備 和方法，如HemaXis?（DBS System SA，Gland，Switzerland）、hemaPEN?（Trajan Scientific and Medical，Australia）采血裝置、VAMS?（volumetric absorptive microsampling，Neoteryx，USA）技術(shù)等，見圖1（a）、（b）、（c）。這些裝置通過手指采血后可自動形成DBS，而不需要手動點樣制備DBS，并且hemaPEN、VAMS采樣技術(shù)可形成4個體積相同的DBS樣本［18］。此外，也有可以從上臂采血的微創(chuàng)微采樣裝置，如TAPTM（Seventh Sense Biosystems，USA）采血設(shè)備，見圖1（d），緊貼上臂，一次性微型針頭以無痛的方式收集100μL的血液，之后可使用移液槍將20μL血液直接滴到采樣卡的圓圈內(nèi)制備DBS［19］。TASSO?Sport On?Demand?（TASSO，USA）采血和樣本收集設(shè)備見圖1（e），在上臂無痛采血后可自動形成4個20μL（20μL±5%）的DBS樣本，與傳統(tǒng)的手指刺血針和DBS卡相比，此過程能通過完全集成的設(shè)備，實現(xiàn)更加一致、安全和快速的DBS樣品采集過程［13，20］。Fluispotter?采血裝置見圖1（f），通過上臂采血，可連續(xù)形成多個DBS樣本［21］。這些新型的DBS采血設(shè)備的出現(xiàn)更加有利于DBS技術(shù)在反興奮劑領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。

圖1新型DBS采血設(shè)備與技術(shù)Figure 1 Novel blood collection equipment and technology of DBS

1.2 樣品的保存與運輸

在目前的興奮劑檢查程序中，運動員的血液或尿液樣本均以液體的形式進行運輸和儲存，采集的全血樣本和尿液樣本需在低溫環(huán)境下進行儲存與運輸，對物流的要求較高（如冰箱、冷凍柜和干冰專用包裝等）。部分樣本還需長期低溫保存以備再次檢查。然而，即使保存在-80℃冰箱中，尿液和血液中的部分代謝物濃度仍會緩慢發(fā)生變化，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。DBS樣本易于保存與運輸，樣品保存于帶干燥劑的密封袋中，可在室溫下儲存數(shù)周至數(shù)年，如果樣品含有不穩(wěn)定的化合物，則應(yīng)根據(jù)實際情況儲存在低溫（2～8℃或≤-60℃）環(huán)境中。并且，按照上述方法包裝的DBS樣本可通過郵寄方式運輸，不僅降低了樣本的保存和運輸成本，而且還大大減少了因血樣暴露而導(dǎo)致的感染等問題［7，26］。此外，DBS樣本中的分析物通常表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，與傳統(tǒng)的樣本基質(zhì)（尿液、全血、血清、血漿）相比，DBS的基質(zhì)性質(zhì)以及分析物的吸附作用使得DBS中的分析物有較低的反應(yīng)性［1］。DBS樣本穩(wěn)定性的提高可能是由于脫水干燥和酶解失活導(dǎo)致，樣品中存留的水分是化合物發(fā)生酶解或水解的關(guān)鍵因素［4，7］。

使用DBS技術(shù)為微量樣品的采集提供了簡便易行且具有優(yōu)勢的程序。DBS采樣可以采用自采樣的方法在家中或遠(yuǎn)程進行樣本采集，運輸方式簡便，無復(fù)雜的運輸要求，降低了運輸和存儲成本，并在一定程度上改善了目標(biāo)分析物在樣本基質(zhì)中的穩(wěn)定性，在整個程序中顯著降低了接觸人員受感染的概率。基于DBS技術(shù)的這些優(yōu)勢，在某些不確定和特殊的情況下，也可能會實現(xiàn)通過遠(yuǎn)程監(jiān)督的方式采集并獲得樣本，以維護興奮劑檢查程序和體育運動的完整性。

2 DBS采樣技術(shù)在興奮劑檢測中的應(yīng)用研究

WADA公布的禁用清單包括對所有運動項目都禁用的蛋白同化制劑、肽類激素、利尿劑、糖皮質(zhì)激素等10大類禁用物質(zhì)和3類禁用方法，另外，還包括一類在某些特殊運動項目中禁用的β?阻斷劑。禁用清單中列出的物質(zhì)數(shù)量每年都在增加，并且許多物質(zhì)并不是只有單一的分析目標(biāo)，必須通過不同的代謝物、降解產(chǎn)物或生物標(biāo)記物等進行監(jiān)測。目前，已有研究［27］開發(fā)建立了450種興奮劑類物質(zhì)的篩查方法。興奮劑檢測采集的樣本大部分是尿液樣本。使用尿液樣本進行興奮劑檢測仍存在一些不足之處。利尿劑的使用使尿液稀釋，降低了尿液中目標(biāo)分析物的濃度。碳酸氫鈉等堿性物質(zhì)的使用，減少了某些禁用物質(zhì)的尿排泄［28-29］，這些都增加了對尿液樣本中禁用物質(zhì)的檢測難度。DBS作為一種補充基質(zhì)，將在興奮劑檢測中發(fā)揮其潛在應(yīng)用價值。對于DBS采樣技術(shù)在各類禁用物質(zhì)檢測方面的應(yīng)用已有較多研究，并且在國際上也已有部分實驗室嘗試使用DBS技術(shù)進行興奮劑檢測。在PubMed［30］上以“dried blood spot and doping”“dried blood spot and LC?MS”為檢索關(guān)鍵詞對近10年的文獻進行檢索，分別檢索到34篇文獻和348篇文獻，筆者在檢索到的文獻中對當(dāng)前DBS技術(shù)在各類禁用物質(zhì)和禁用方法檢測研究中所占的比例進行統(tǒng)計，綜述DBS技術(shù)在蛋白同化制劑、肽類激素、血液興奮劑以及賽內(nèi)禁用物質(zhì)檢測中的研究進展（圖2）。

圖2 2010—2020年DBS技術(shù)在各類禁用物質(zhì)和禁用方法檢測中的文獻統(tǒng)計結(jié)果Figure 2 The literature statistics of DBS technology in the detection of various prohibited substances and methods from 2010 to 2020

2.1 DBS與蛋白同化制劑檢測

據(jù)WADA統(tǒng)計，興奮劑違規(guī)事件中近半數(shù)是合成類固醇類興奮劑違規(guī)，因此，合成類固醇類興奮劑的準(zhǔn)確篩查一直是研究人員關(guān)注的重點。目前實驗室常規(guī)檢測的類固醇類興奮劑及其代謝物種類近100種，其中存在大量同分異構(gòu)體，還包含部分種類的內(nèi)源性類固醇。該類物質(zhì)特有的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其質(zhì)譜檢測靈敏度較差，目前多采用衍生后進行氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）的方法進行檢測［31］，內(nèi)源性類固醇興奮劑的外部攝入還需要同位素比質(zhì)譜（IRMS）進行確證［32］。而在進行IRMS檢測前，需要對樣本進行精細(xì)純化，并且分析通量低，檢測成本也相對較高。因此，基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)的類固醇類興奮劑的檢測方法開發(fā)，以及外源攝入的內(nèi)源性類固醇特異性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與檢測工作一直備受關(guān)注［33-34］。在世界體育運動中，睪酮是類固醇類興奮劑的主要濫用物質(zhì)［35］，睪酮有多種形式和劑量，最廣泛的使用形式是肌內(nèi)注射睪酮酯，十一酸睪酮酯也可以口服給藥。睪酮進入血液循環(huán)后吸收會減慢，從而產(chǎn)生長效作用［36-37］。當(dāng)口服或注射睪酮酯制劑后，該酯會緩慢擴散到血液中。盡管酯酶的酶解過程立即開始，但在血液中仍可檢測到一定比例的睪酮酯原型［38-42］。在尿液中不存在睪酮酯原型形式，而是完全以少量游離睪酮及其代謝物的形式存在，因此，尿液樣本中內(nèi)源性睪酮和外源攝入的睪酮混合存在，常規(guī)檢測難以區(qū)分。但如果在血液樣本中檢測到痕量睪酮酯的存在，即可確認(rèn)其興奮劑違規(guī)。對6位志愿者分別單次注射不同睪酮酯制劑后，通過液相色譜質(zhì)譜（LC?MS）檢測技術(shù)，在給藥后血樣中可直接檢測到睪酮酯。檢測時間在4 d到2個月以上，具體取決于所用酯的類型。通過血液樣本檢測睪酮酯可作為IRMS睪酮確證分析的補充［41］。Tretzel等［42］通過LC-MS/MS分析方法檢測了DBS樣本中8種類固醇興奮劑的酯化合物。該方法顯著提高了檢測類固醇類禁用物質(zhì)的準(zhǔn)確度以及靈敏度，在定性檢測分析合成類固醇類禁用物質(zhì)方面具有一定優(yōu)勢［40］。

對于其他蛋白同化制劑，應(yīng)用DBS也可能會提高檢測靈敏度以及檢出率。6個受試者一次給藥80μg的克倫特羅（比受污染肉中的劑量高），給藥后24 h的2個尿液樣本以及給藥后3～10 d收集的所有尿液樣本中克倫特羅濃度均低于5 ng/mL，個體間的尿液濃度差異很大［43］。根據(jù)《世界反興奮劑條例》第7.4條的修訂，尿液中克倫特羅濃度低于5 ng/mL的情況應(yīng)報告為“ATF”（atypical finding），而不是“AAF”（adverse analytical finding）［44］，這是因為尿液中克倫特羅水平低可能是由于攝入了受污染的肉所致［45-46］。而DBS樣本在給藥24 h后均可檢測到克倫特羅（濃度均高于5 ng/mL），給藥后3 d的檢出率為50%［43］。

2.2 DBS與肽類激素檢測

近10年來，低分子質(zhì)量（＜2 kDa）肽類和非肽類模擬物違禁物質(zhì)的使用一直是預(yù)防性興奮劑研究的重點。藥 代 動力學(xué)研究表 明，血液中GHRP?2［47］和GHRP?6［48］有較高的清除率。在尿液基質(zhì)中，肽類藥物與其代謝物同時存在，并且有研究［49-50］發(fā)現(xiàn)生長激素釋放的肽GHRP?1和alexamorelin在尿液中會迅速分解，檢測靈敏度也低于其代謝物。Lange等［51］開發(fā)了DBS樣本中肽類激素及其釋放因子的檢測方法，該方法采用LC?HRMS（液相?高分辨質(zhì)譜）檢測技術(shù)以及全自動DBS樣本提取和在線固相萃取技術(shù)。目標(biāo)分析物包括46種分子量小于2kDa的低分子量肽或非肽（模擬物），如促性腺激素釋放激素、生長激素釋放肽和抗利尿激素（血管升壓素）等。此外，還檢測了9種GHRP的甘氨酸衍生物，這些衍生物被認(rèn)為可能是潛在的新型興奮劑。經(jīng)過人體試驗后，該方法也能成功檢測到GHRP?2和GHRP?6。Cox等［52］開發(fā)了基于運動員DBS樣本的胰島素樣生長因子?1（IGF?1）LC?MS檢測方法。IGF?1是生長激素（hGH）作用的主要中介物，可作為檢測重組人生長激素（rhGH）濫用的生物標(biāo)志物。DBS也可用于直接檢測rhGH［53］，以及應(yīng)用于蛋白標(biāo)志物如纖維連接蛋白1（fibronectin 1）等間接檢測方法［54］。

2.3 DBS與血液興奮劑檢測

在血液興奮劑檢測方面，目前對于運動員自體輸血等血液興奮劑的檢測方式，通常使用運動員生物護照（ABP）的血液學(xué)模塊進行檢測，主要是通過監(jiān)測血紅蛋白濃度［Hb］和網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比（Ret%）等指標(biāo)隨時間的變化情況進行間接檢測［55-57］。該方法也有一定的局限性，并且對血液樣本的采集、運輸、檢測以及穩(wěn)定性都具有較高的要求。DBS采樣技術(shù)在采集、運輸以及保證樣本的穩(wěn)定性方面具有一定優(yōu)勢。DBS作為樣本基質(zhì)進行血液興奮劑檢測已有多項研究，DBS既可應(yīng)用于重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）的直接檢測［58］，也可應(yīng)用于通過轉(zhuǎn)錄組標(biāo)記物或蛋白標(biāo)記物來檢測血液興奮劑的間接檢測方法。DBS樣本中RNA生物標(biāo)志物可以有效地檢測血液興奮劑，紅細(xì)胞生成相關(guān)的ALAS2L、ALAS2LC、CA1和SLC4A1等基因表達(dá)水平隨興奮劑的使用而變化［19，59-60］。

通過LC?MS檢測DBS中的膜蛋白CD45、CD41、Band3、CD71等可間接檢測血液興奮劑的使用。該方法可對目前監(jiān)測的血液參數(shù)進行穩(wěn)定的縱向測量，以檢測血液興奮劑的使用［61］。其中CD71在未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞（IRC）中高度表達(dá)，負(fù)責(zé)將鐵轉(zhuǎn)運到細(xì)胞中以進行血紅蛋白合成［62］，在網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過程中表達(dá)降低，而在成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞（RBC）中不存在［63-64］。與Ret%相比，CD71對紅細(xì)胞生成的變化更敏感，可以提高檢測靈敏度［54］。但是，缺鐵性貧血也會使血液中的CD71增加［65］，尤其是在女子馬拉松運動員、徑賽運動員和鐵人三項運動員中較常見［66-67］。因此，同時測量DBS中的血紅蛋白濃度將有助于檢測貧血運動員［61］，并進一步進行受試者給藥試驗研究，以確定DBS方法檢測血液興奮劑的有效性。另外，還有研究［68］發(fā)現(xiàn)通過LC-MS/MS檢測DBS樣本中的CD71/Band3比例能夠提高自體輸血的檢出率。CD71/Band3比例反映了血液中的未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞占紅細(xì)胞的百分比，它對紅細(xì)胞生成的變化比Ret%更為敏感［68］。但是還需要進一步檢測以確定CD71/Band3比例的縱向穩(wěn)定性，以及對海拔高度、高強度運動和rhEPO微劑量方法的反應(yīng)。WADA在關(guān)于DBS應(yīng)用于血液興奮劑檢測的研究中指出，無論是直接檢測還是通過縱向檢測方式（CD71+細(xì)胞），從干血點中檢測紅細(xì)胞生成刺激劑（ESA）濫用的能力對于未來的興奮劑檢測至關(guān)重要［69］。同時，WADA也積極鼓勵在DBS中探索研究ABP血液學(xué)模塊的新型鑒別標(biāo)記物或干擾因子的標(biāo)記物［70］。

2.4 DBS與賽內(nèi)禁用物質(zhì)檢測

在目前執(zhí)行的WADA禁用清單中，有4類禁用物質(zhì)僅在比賽期間禁止使用，包括刺激劑、麻醉劑、大麻（酚）類和糖皮質(zhì)激素類。DBS被認(rèn)為是一種檢測禁用藥物的補充基質(zhì)，特別是對于僅在比賽中禁止使用的物質(zhì)，賽前或賽后的DBS檢測可以監(jiān)測運動員在比賽期間的血藥濃度水平，是對尿液樣本檢測的一種補充方法［71］。有研究通過液相色譜質(zhì)譜檢測法對比了使用尿液樣本與DBS樣本檢測麻黃堿和甲基麻黃堿的有效性，結(jié)果表明，麻黃堿和甲基麻黃堿在尿液中的排泄量較易受到尿液pH值和尿量的影響，并且麻黃堿在尿液中的濃度不能反映循環(huán)中神經(jīng)刺激水平，而血藥濃度之間的個體差異較小，DBS樣本檢測方法可能更適用于比賽期間對刺激劑的檢測［14，72］。DBS與常規(guī)興奮劑檢測的尿液樣本共同采集檢測，能產(chǎn)生更大的優(yōu)勢和應(yīng)用價值。

3 DBS采樣技術(shù)應(yīng)用前景展望

目前，用于興奮劑檢測的樣本主要是全血、血清和尿液樣本。這些樣本基質(zhì)要在嚴(yán)格控制的條件下從采樣點收集并轉(zhuǎn)移到獲得認(rèn)證的反興奮劑實驗室進行檢測分析。基于當(dāng)前整個程序的時間和成本效益、采樣方式的侵入性、分析物的穩(wěn)定性，以及后續(xù)的檢測分析乃至興奮劑結(jié)果管理等多方面，發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用一種有潛在價值的補充基質(zhì)或替代基質(zhì)是必要的［73］。DBS技術(shù)在反興奮領(lǐng)域中有較好的應(yīng)用前景。如上文中所闡述的，無論是在樣本的采集、運輸、儲存、分析物穩(wěn)定性等方面，還是在興奮劑檢測方面，DBS技術(shù)都具有一定的優(yōu)勢。

當(dāng)前用于興奮劑檢測的血液樣本通常采用靜脈采血的方式獲得。靜脈采血必須由持證的醫(yī)師采集。在大多數(shù)情況下，血液無法在采集地點加工成血清，必須在嚴(yán)格控溫的條件下96 h內(nèi)運送到檢測實驗室［74］。這不僅大大增加了整個檢查程序的成本，而且可能還限制了樣本采集、檢測的時間和地點。DBS技術(shù)為微量樣本采集提供了簡捷可行的方法。DBS樣本的采集不僅具有微創(chuàng)性，而且采集樣本量少、采集方式簡單，能滿足自我取樣、非醫(yī)學(xué)技術(shù)專業(yè)人員取樣等，因此，DBS樣本的采集不會受到采樣地點和采樣人員等方面的限制，這也體現(xiàn)了DBS采樣技術(shù)的優(yōu)勢。并且，與傳統(tǒng)的尿液和血液樣本相比，DBS樣本減少了繁雜的運輸和存儲要求，降低了樣本運輸和樣本制備的成本。基于在采集、運輸和存儲上的優(yōu)勢，DBS樣本能提高分析物和生物標(biāo)記物的穩(wěn)定性，同時也大大降低了接觸感染的發(fā)生率。在生物樣本的采樣、運輸和儲存方面，使用DBS技術(shù)進行的微采樣分析是一種更具優(yōu)勢的替代方法。

除了微創(chuàng)樣本采集程序及其經(jīng)濟優(yōu)勢外，DBS在興奮劑檢測方面同樣表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。DBS雖然樣本量少，但通常與LC?MS聯(lián)用，因此，具有較高的檢測靈敏度、精密度與準(zhǔn)確度。目前研究表明，DBS能夠檢測出WADA公布的禁用清單中不同種類的違禁物質(zhì)和方法，包括蛋白同化制劑，肽類激素、生長因子相關(guān)物質(zhì)和模擬物，β2?激動劑，激素及代謝調(diào)節(jié)劑，利尿劑和掩蔽劑，刺激劑，麻醉劑，大麻（酚）類，糖皮質(zhì)激素類以及β?阻斷劑等［13］，DBS作為一種新的樣本基質(zhì)在興奮劑檢測中具有較好的應(yīng)用前景。應(yīng)用DBS可能會提高某些禁用物質(zhì)（如合成類固醇類物質(zhì)）的檢測靈敏度以及檢出率。其特有的化學(xué)結(jié)構(gòu)使該類物質(zhì)檢測靈敏度較低，并且該類物質(zhì)存在大量同分異構(gòu)體，還包含部分種類的內(nèi)源性類固醇，使其檢測程序更復(fù)雜，分析通量低并且成本高。此外，當(dāng)前采用的尿液基質(zhì)中不存在其酯類形式，而血液基質(zhì)中則存在，因此，DBS樣本提供了一種更具優(yōu)勢的補充基質(zhì)。

對于半衰期較短的物質(zhì)（如rhGH），直接檢測方式在一定程度上存在局限性，檢測窗口期較短；而rhGH注射后會導(dǎo)致體內(nèi)多種生物指標(biāo)發(fā)生變化，這些指標(biāo)在人體內(nèi)有更長的半衰期，同時受運動、禁食等狀態(tài)的影響較小［74］，因此，對rhGH相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)進行間接檢測具有重要的實用價值。與直接檢測法相比，間接檢測法增加了rhGH使用后的可檢出時間。并且，此類物質(zhì)是賽內(nèi)、賽外均被禁用的物質(zhì)，因此要經(jīng)常進行檢測。使用DBS技術(shù)檢測IGF?1以間接監(jiān)測體育運動中的生長激素濫用［52］。這就提供了一種更容易實現(xiàn)的方法，在沒有持證醫(yī)師的情況下，可以經(jīng)常、不定期地在賽外通過指尖采血或其他DBS采樣裝置收集樣本，采樣量少，具有微創(chuàng)性，同時運輸和存儲成本較低。這種頻繁持續(xù)的檢測方法還可以為運動員個人提供更多的數(shù)據(jù)點，建立一個可以用于生長激素等其他禁用物質(zhì)生物標(biāo)志物的生物護照，類似于目前用于檢測血液興奮劑的生物護照。基于DBS?LC?MS的間接檢測方法可提高檢測靈敏度以及檢出率，該方法可能是興奮劑檢測中具有潛在優(yōu)勢的補充或替代方法。

然而，目前DBS樣本分析的前處理方法可能是影響該技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用的主要因素之一。由于樣本容量有限以及高度復(fù)雜的樣本基質(zhì)（包括溶血的血細(xì)胞和高含量的可溶性和不溶性蛋白質(zhì)等），這些都可能影響對目標(biāo)物的分析檢測。自動DBS樣品制備工作系統(tǒng)與LC?MS的結(jié)合使用，有助于克服這一局限。傳統(tǒng)的DBS樣本處理是離線脫機進行的，通常需要進行液液萃取（liquid?liquid extraction，LLE）或固相萃取（solid?phase extraction，SPE），以達(dá)到樣本凈化和分析物富集的效果［75］，見圖3（a）。盡管用于離線DBS提取的過程相對簡單，但手動打孔的步驟非常繁瑣且耗時，尤其是在需要處理大量樣品的情況下，這大大降低了樣品通量。這可能是阻礙DBS采樣技術(shù)廣泛應(yīng)用的一個因素。在線DBS提取和分析的全自動系統(tǒng)可能是解決這種障礙的有效方式。該系統(tǒng)通過一定量的溶劑流穿干血點的限定區(qū)域以解吸分析物，并通過在線SPE系統(tǒng)實現(xiàn)凈化和富集，然后進入LC?MS系統(tǒng)進行分離和檢測［74］，見圖3（b）。該技術(shù)避免了復(fù)雜耗時的手動打孔以及樣本離線處理過程，從而提高萃取效率，減少分析物損失，并因此提高分析的靈敏度。同時，DBS全自動前處理儀器可直接與MS連接，能夠?qū)崿F(xiàn)樣本高通量。

圖3 DBS樣本處理和分析流程Figure 3 Sample processing and analysis process

DBS分析中要考慮的另一個方面是“血細(xì)胞比容（Hct）效應(yīng)”［51，76］。血液在DBS濾紙上的擴散程度會影響DBS的定量分析，引起Hct依賴性偏差［51］。這種基于Hct的偏差來自以下3個方面：①由于血液的黏度與Hct呈正相關(guān)，因此與低Hct的血液相比，高Hct的血液在濾紙上的擴散程度較小。當(dāng)將相同體積的血液加到濾紙上時，與低Hct的血液相比，較高的Hct的血液會產(chǎn)生較小直徑的斑點。因此，當(dāng)對高Hct的DBS進行打孔分析時，可能導(dǎo)致測量值偏高。②Hct效應(yīng)可能影響萃取效率并因此影響分析物的回收率。在一般情況下，高Hct的DBS可能使分析物的萃取效率和回收率降低，導(dǎo)致測量值偏低。③具有不同Hct的樣本也可以被認(rèn)為是不同的基質(zhì)，可能引起Hct依賴性基質(zhì)效應(yīng)［18］。

因此，對DBS樣本進行Hct測定可能是克服這一局限性的方法之一。DBS樣本中鉀離子（K+）濃度是Hct的有效標(biāo)記物，可通過測定DBS萃取液中K+濃度來間接檢測DBS，并且K+濃度測定法可以校正咖啡因及其代謝物定量檢測中的Hct依賴性偏差［77］。近來，有研究發(fā)現(xiàn)，在DBS樣本進行前處理和分析之前，可通過近紅外（near infrared，NIR）光譜法實現(xiàn)對DBS樣本Hct的非破壞性檢測［51］，可在DBS全自動處理分析系統(tǒng)前聯(lián)用在線近紅外光譜儀，實現(xiàn)一體化自動化測定。Hct檢測方法的引入對興奮劑檢測有一定的價值，它可以通過Hct校正對分析物進行有效的定量檢測。此外，近來一些新興的微量采樣裝置和技術(shù)的出現(xiàn)可實現(xiàn)干血點體積和容量的固定，從而減少Hct效應(yīng)。如VAMS技術(shù)采用指尖采血后，通過VAMS裝置可獲得容量體積一致的DBS樣本。hemaPEN技術(shù)可直接進行指尖采血，并可一次收集4個體積固定的樣品，將血液定量地收集到預(yù)先打孔的濾紙圓片上。Deprez等［18］的研究對hemaPEN制備的DBS與傳統(tǒng)點樣制備的DBS進行了對比分析，通過LC?MS/MS定量測定不同方式制備的DBS中的咖啡因及其代謝物副黃嘌呤，結(jié)果表明，hemaPEN生成的DBS，其定量結(jié)果受Hct的影響更小，hemaPEN裝置對Hct有更低的依賴性。通過LC?MS分析Fluispotter連續(xù)點樣的DBS樣本中的皮質(zhì)醇濃度，與血漿樣本的皮質(zhì)醇濃度具有良好的一致性，DBS樣本有較小的Hct效應(yīng)。Fluispotter具有克服DBS定量分析中與Hct相關(guān)的樣品血容量變化的潛力［21］。因此，使用DBS進行定量測定時，可采用相應(yīng)的方式減少Hct對結(jié)果的影響。但是，使用DBS進行定性分析時，不同的Hct對定性物質(zhì)的檢測無顯著影響［51］。

DBS采樣技術(shù)在結(jié)果管理程序中也有重要的實用價值［71］。對于賽內(nèi)禁用物質(zhì)，同時檢測其血液濃度水平，將有利于改進常規(guī)的興奮劑檢測方法。DBS采樣技術(shù)是一種簡單且實用的補充方法，可提供目標(biāo)分析物的血液濃度數(shù)據(jù)，從而為結(jié)果管理程序提供了更多、更準(zhǔn)確的結(jié)果判定材料支持。DBS采樣技術(shù)將有很大的潛力來補充和改善常規(guī)興奮劑檢查程序。

由于禁用物質(zhì)檢測方法的不斷改進，WADA允許對樣本進行長達(dá)10 a的再分析，因此，DBS樣本便捷、可長期存儲的儲存方式以及樣本中分析物的化學(xué)穩(wěn)定性是其優(yōu)勢所在。此外，DBS樣本的制備和分析是可自動化的，有望實現(xiàn)有效的高通量檢測。并且，與傳統(tǒng)的基質(zhì)相比較，DBS樣本在興奮劑檢測中也具有一定的優(yōu)勢，DBS樣本在大多數(shù)類型禁用物質(zhì)的檢測中均有研究，是一種良好的替代或補充基質(zhì)。雖然DBS采樣技術(shù)在反興奮劑領(lǐng)域中處于起步階段，但這種實用而有效的微量采樣程序有望獲得更加廣泛的應(yīng)用。

4 結(jié)束語

隨著實驗室檢測程序自動化程度的不斷提高，樣本檢測分析前步驟的簡化和加速顯得越來越重要。在不影響所需樣本質(zhì)量的前提下，DBS樣本的采集在時間消耗、工作量和成本等各方面均表現(xiàn)出優(yōu)勢，簡便快捷的特性使其在整個分析檢測流程中易于實施與應(yīng)用，從而提高檢測的效率和有效性。DBS采樣技術(shù)作為一種新型的采樣方式，將會使樣本采集、運輸、儲存乃至興奮劑結(jié)果管理產(chǎn)生較大的改進。同時，也應(yīng)不斷完善DBS采樣技術(shù)，積極開發(fā)全自動DBS樣本處理分析方法，不斷擴大DBS中禁用物質(zhì)的檢測范圍，研究開發(fā)新的DBS檢測方法，如開發(fā)和確認(rèn)一種新的分析方法，用于檢測和定量DBS中的人絨毛膜促性腺激素（HCG）等［70］。由此，液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的DBS分析方法將在興奮劑檢測領(lǐng)域中得到更加廣泛的應(yīng)用。此外，也應(yīng)積極探討發(fā)現(xiàn)其他樣本基質(zhì)和樣本采集方法，如干血漿采樣技術(shù)（dried plasma spot，DPS）在興奮劑檢測領(lǐng)域中的潛在優(yōu)勢［71］，從而為加強反興奮劑工作作出更大的貢獻。