強化生物堆法修復多環芳烴污染土壤的初步研究

謝林培，祝沖之,2，張曉東,2，余 冉①，展漫軍，孫麗偉

(1.東南大學能源與環境學院，江蘇 南京 210096；2.生態環境部南京環境科學研究所，江蘇 南京 210042；3.南京市環境保護科學研究院，江蘇 南京 210013)

多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs)是由2個或多個苯環以直接連接、彎曲連接或聚集方式構成的特殊化合物。PAHs具有熔點和沸點較高、低水溶性、蒸汽壓小、熱穩定以及難降解等特點[1]，主要產生于有機物質不完全燃燒過程以及石油開采、運輸、生產和使用過程中發生的溢油事件[2]。PAHs對生物體具有致癌、致畸和致突變的“三致作用”，是環境中普遍存在的有毒污染物[3]。PAHs可通過沉降和遷移進入土壤和水體，并可通過直接接觸和食物鏈進入人體而危害公共健康[4]。2014年《全國土壤污染狀況調查公報》中明確指出有機污染物主要在工業廢棄地、工業園區、采油區、采礦區、污水灌溉區和干線公路兩側累積[5]。目前，GB 36600—2018《土壤環境質量 建設用地土壤污染風險管控標準(試行)》中有限值的PAHs(最低限值)有8種，分別為萘(25 mg·kg-1)、苯并[a]蒽(5.5 mg·kg-1)、苯并[a]芘(0.55 mg·kg-1)、(490 mg·kg-1)、苯并[b]熒蒽(5.5mg·kg-1)、苯并[k]熒蒽(55 mg·kg-1)、茚并[1，2，3-cd]芘(5.5 mg·kg-1)和二苯并[a，h]蒽(0.55 mg·kg-1)[6]。在產或退役農藥廠場地土壤中除檢出農藥類特征污染物外，同時還檢測出一定數量的PAHs[7]。因此修復PAHs污染土壤是緊迫和棘手的熱點研究問題之一。

污染土壤中PAHs可以采用物理、化學和生物修復法中的一種或多種聯合去除。傳統物理修復技術有客土法、填埋法、焚燒法、隔離法和換土法等[3]，化學修復技術有化學淋洗法、萃取法、化學氧化法和光催化降解技術等[8]。但是物理和化學修復法存在處理成本高、去除不徹底、易導致二次污染等缺點。生物修復法指利用特定生物降解土壤中污染物，或將其轉化為無害物質[9]。微生物修復技術具有使用成本低、無二次污染、可以大面積普及使用等優點，被認為是具有廣泛應用潛力的有效措施。相關研究[10]已發現微生物降解是污染土壤和沉積物中PAHs的主要自然去除途徑。

微生物經過自然馴化，能以PAHs作為碳源用于生長繁殖[10]。但目前已發現的多種微生物僅能降解單一PAHs，而PAHs污染土壤通常具有復合污染特性。同時，微生物由于代謝通路限制，無法降解所有類型PAHs，或將其完全降解，并極有可能產生有毒降解副產物[11]。因此，需要利用混合菌群協同作用，如共代謝作用等，并通過改善微生物作用環境以刺激微生物活性增強，如曝氣、添加必要營養物質等。鑒于PAHs的水溶性差，生物可獲得性低，原位PAHs生物修復效果無法保證，有研究者嘗試添加表面活性劑改善土壤中PAHs溶解性，增加它們的生物利用度[12-13]。表面活性劑可分成離子型和非離子型2大類。非離子表面活性劑，如Tween 80，基團之間排斥力較弱，對PAHs的溶解能力比離子型表面活性劑高，并且具有可生物降解、在固體表面不易吸附和環境友好的優點，常應用于土壤修復中[14-16]。生物堆處理技術是一種新型異位生物修復技術，是將大量污染土壤混合堆積成堆體，并通過調節氧氣、水分和養分以最大程度促進微生物好氧降解污染物[17]。

通過生物堆反應模擬裝置，對采用生物堆修復技術處置PAHs污染土壤的工藝條件進行優化并探討其影響因素，篩選富集PAHs的高效降解混菌，研究投加降解菌對生物堆技術處理PAHs污染土壤的強化效果，同時研究非離子表面活性劑Tween 80對改善PAHs生物可獲得性、提高PAHs生物降解效率的影響機制，研究可為PAHs污染工業場地土壤修復提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與裝置

PAHs污染土壤取自江蘇南京某化工廠退役場地，其pH值為8.33±0.39，含水率為(20.8±1.3)%，有機質含量為(32.6±2.9) g·kg-1，全氮含量為(84.93±31.10) mg·kg-1，全磷含量為(18.13±0.53) mg·kg-1。土壤中含有16種美國環保署優先控制PAHs，其平均含量為479.9～1 337.4 mg·kg-1，其中低分子質量PAHs(2～3環)質量占總PAHs質量的75.1%，中分子質量PAHs(4環)占17.8%，高分子質量PAHs(5～6環)占9.1%。

這16種PAHs的混合標準品選擇EPA610(美國o2si標準品公司)。

1.2 PAHs降解混菌的篩選富集

采用尿素和磷酸二氫鉀將污染土壤m(C)∶m(N)∶m(P)調節為100∶20∶1后，稱取100 g土壤懸浮于裝有0.5 L超純水的1 L燒杯中，以150 r·min-1攪拌2 h后取懸浮液以轉速為6 755 r·min-1(離心半徑為9.8 cm)離心10 min，取上清液經0.45 μm濾膜過濾、高壓蒸汽滅菌(121 ℃，30 min)，獲得作為PAHs降解混菌富集培養所用的培養液。

將10 g PAHs污染土壤接種到100 mL培養液中于室溫條件下培養8 h，過中速定量濾紙，取上清液10 mL接種到90 mL新鮮培養液中，再加入10 mL PAHs混合標準品溶液(16種PAHs質量濃度均為5 mg·L-1)。在25 ℃、遮光條件下以150 r·min-1振蕩培養16 d。采用分光光度計監測菌液在600 nm波長處的吸光度(D600)。取菌液D600值最大時的混菌菌液用于后續生物堆實驗研究，以驗證其實際PAHs降解效能。

1.3 生物堆降解實驗設計

生物堆降解實驗在自制反應器(圖1)中進行。反應器主體為圓柱體不銹鋼容器，加帶密封圈的蓋子以確保密閉性。下層底部鋪設不銹鋼曝氣穿孔管，同時用三腳架支撐不銹鋼穿孔板，上鋪紗布，用于承載污染土壤。曝氣管與空氣泵相連接，氣泵啟停由定時器控制，曝氣管連接轉子流量計以控制曝氣流量。反應器頂部蓋子開一小孔，以連接裝有活性炭的廢氣吸收裝置。

向PAHs污染土壤中混入w為1%的短稻草(長度為0.5～1.0 cm)和w為25%的沙子(粒徑為0.150～0.250 mm)，以改善土壤透氣性。加入尿素和磷酸二氫鉀調節m(C)∶m(N)∶m(P)為100∶20∶1，混合均勻后分裝到4個平行反應器中。試驗設置4個處理:1#為對照；2#添加1 000 mg·kg-1的Tween 80；3#以30 mL·min-1通氣速率進行通氣；4#添加1 000 mg·kg-1Tween 80并以30 mL·min-1通氣速率通氣(表1)。通風方式采用間歇通風，每隔4 h通風4 h。試驗31 d時，采用噴瓶向3#和4#處理反應器噴灑10 mL·kg-1已篩選富集的PAHs降解菌劑，邊噴灑邊攪拌，使菌液與土壤均勻混合。

表1 實驗條件設置

以預處理后分裝到反應器前的土壤為0 d時樣品，分別在9、16、23、31、41和80 d時于反應器上、中和下層分別隨機取3個樣混合，共約150 g。取樣后向通風的3#和4#處理反應器加入適量水，保持土壤含水率穩定在20%～30%。

1.4 分析方法

1.4.1PAHs的分析方法

采用氣相色譜-質譜法測定土壤中PAHs含量。稱取土壤樣品10 g(精確至0.1 g)，與適量硅藻土混合研磨后，采用戴安ASE300加速溶劑萃取儀進行提取。提取劑為丙酮和二氯甲烷(體積比為1∶1)，提取溫度為100 ℃，提取時間為10 min。提取液用KD濃縮器濃縮至約1 mL，加入1 mL正己烷后繼續濃縮，再用正己烷定容至1 mL后采用安捷倫7890-5977B氣質聯用儀測定。儀器條件參照HJ 834—2017《土壤和沉積物 半揮發性有機物的測定 氣相色譜-質譜法》。

試驗質量控制采用空白加標、基質加標、樣品平行和添加替代物方式。空白加標16種PAHs標準樣品的回收率為74.0%～100.0%，基質加標的平均回收率為76.0%～90.0%。2-氟苯酚、苯酚-d6、硝基苯-d5、2-氟聯苯、2，4，6-三溴苯酚和對-三聯苯-d14這6種替代物的回收率為70%～110%。

1.4.2脫氫酶活性的分析方法

土壤脫氫酶活性測定采用三苯基四氮唑氯化物(TTC)法。在含有1.00 g土壤樣品的25 mL試管中加入2.5 mL Tris-TTC溶液(ρ為10 g·L-1，pH值為7.6)，振蕩試管使土壤顆粒與溶液充分混合，于37 ℃暗處孵育24 h。取出后加入10 mL乙醇溶液，渦旋1 min后靜置，過0.45 μm濾膜過濾，將濾液在1 h內于485 nm波長下測吸光度。同時設置無土壤的對照組和以1% Tris溶液代替1% Tris-TTC溶液的對照組。

2 結果與討論

2.1 PAHs降解混菌的篩選富集

在一定范圍內，菌液中微生物細胞濃度與D600值呈正比。在添加外源PAHs的土壤滲濾液中進行PAHs降解混菌的富集篩選培養，并監測培養液D600變化以指示生物量變化。經過4 d的生長適應期后，降解混菌進入對數增長期，其D600從0.029增長到8 d時的0.331，之后進入穩定衰亡期(圖2)。因此收集培養8 d時處于快速增長期的混菌菌液用于后續生物堆實驗。

2.2 土壤PAHs含量變化

生物堆反應器運行期間，土壤pH和含水率基本保持穩定，含水率在20%～25%之間，pH值維持在8.4～9.0之間。由圖3可知，1#～4#處理9 d時總PAHs降解率分別為84%、90%、86%和85%，各處理80 d時總PAHs降解率均在83%～85%之間。

由圖4可知，不同分子質量PAHs降解速率存在明顯差異，低分子質量PAHs在9 d內減少91%，反應9 d時平均降解速率為49 mg·kg-1·d-1；而中、高分子質量PAHs只有60%被降解，反應9 d時平均降解速率分別僅為8.4和4.2 mg·kg-1·d-1。已有研究表明，低分子質量的萘在土壤中半衰期約為2 d[18]，菲的半衰期約為17 d[19]，而4～6環的中高分子質量PAHs半衰期大于100 d[20]。因此，低分子質量PAHs較容易被污染土壤中土著微生物代謝降解，PAHs環數越高，降解難度越大。此外，土壤受污染時間也影響其對污染物的生物降解能力。有研究[21]表明污染200 d的土壤中PAHs降解速率高于污染50 d的土壤。MACLEOD等[22]研究了芘在牧地和林地2種土壤中的降解，發現隨著芘與土壤接觸時間的增加，其降解滯后期顯著減少，降解速率提高。RHODES等[23]研究結果表明，菲與土壤接觸84 d時的降解速率比接觸1 d時更快。因此，研究區土壤由于長期受到PAHs污染，其中的PAHs，尤其是低分子質量PAHs有極強的降解能力，而中高分子質量PAHs降解則需更長時間。

高分子質量PAHs主要以共代謝方式進行生物降解[2]，目前對其降解機制的研究主要集中在5環的苯并[a]芘的厭氧降解。在厭氧條件下，苯并[a]芘首先通過甲基化和還原反應使苯環斷裂，隨后在脫甲基作用下形成苯并[a]蒽和，最終經過甲基化反應形成蒽和菲[24-25]。由圖4可知，生物堆土壤中低、中和高分子質量PAHs含量在41 d時有所提高，這可能是由于高環數PAHs經過一系列生化反應轉化為低環數PAHs[24，26]。

投加Tween 80在試驗期內對生物堆PAHs降解率沒有顯著影響(P>0.05)。添加Tween 80的2#處理PAHs降解率與1#對照相比沒有明顯提高。在通風條件下，與3#處理相比，添加Tween 80的4#處理PAHs降解率也沒有明顯提高(P>0.05)。PAHs水溶性低，微生物只能利用其進入水相的部分，表面活性劑能夠促使PAHs由土壤吸附態或非水相向水相轉移，從而提高PAHs的生物可利用性，促進PAHs生物降解[16]。但筆者試驗中Tween 80的添加對生物堆降解PAHs沒有起到積極作用，這可能是由于9 d時易降解PAHs已基本都被利用，難降解PAHs則需更長的生物反應時間。

同時，經過9 d的生物堆反應，85%以上的PAHs均已被去除，故以30 mL·min-1通風的3#處理PAHs降解效率與1#對照相比沒有明顯差異(P>0.05)。PAHs的微生物降解以好氧降解為主[27-28]。筆者試驗中氧氣可能不是PAHs生物降解速率的限制因素。在生物堆反應31 d后添加10 mL·kg-1PAHs降解混菌的3#和4#處理，總PAHs降解效率與加入菌液前沒有明顯提高，說明土壤中殘留的難降解PAHs需要更長的生物降解時間，同時所投加混菌對難降解PAHs的降解能力還需進一步篩選優化。

2.3 土壤脫氫酶活性變化

由圖5可知，各處理土壤脫氫酶活性在反應前41 d隨反應時間延長緩慢增加，到80 d時，除1#對照外，其他處理土壤脫氫酶活性大幅增加。2#、3#和4#處理80 d時土壤脫氫酶活性較41 d時分別增加3倍、7倍和9倍。脫氫酶能催化有機物脫氫反應，作為氫的中間傳遞體，對有機物氧化還原反應起著重要作用。土壤脫氫酶活性可間接反映土壤微生物對PAHs的降解活性和對土壤有機質的代謝能力[29]。反應0～41 d時，與1#對照相比，2#～4#處理土壤脫氫酶活性均沒有顯著提高。反應41 d后，1#對照土壤脫氫酶活性基本不變，而其他各處理土壤脫氫酶活性顯著提高。各處理80 d時土壤脫氫酶活性由大到小依次為4#(10 740 μg·g-1·h-1)>3#(7 300 μg·g-1·h-1)>2#(3 340 μg·g-1·h-1)>1#(986 μg·g-1·h-1)。而與0 d時相比，各處理9 d時PAHs降解率沒有明顯提高，這說明雖然PAHs尤其是低分子質量PAHs能夠快速降解，但其并未完全礦化，而是轉化為其他中間產物，并在反應41～80 d時被繼續降解。

好氧條件下，PAHs首先在加氧酶催化下轉化為順式或反式二氫二醇化合物，然后在脫氫酶作用下轉化為相應的醇后再進行下一步水解[30]。在厭氧條件下，PAHs首先經歷一系列的甲基化、羥基化反應開環轉化為甲酚，然后在脫氫酶作用下進一步水解[31]。Cycloclasticussp.Strain P1在降解菲和芘的過程中編碼二氫二醇脫氫酶的基因高度表達，在降解萘的過程中編碼二氫二醇脫氫酶的基因和水楊醛脫氫酶的基因特異性上調[32]。Rhodococcussp.P14在PAHs降解過程中脫氫酶基因表達增加，脫氫酶是PAHs降解過程中的限速酶[33]。

在厭氧條件下，菲和芘是Microbacteriumsp. strain M.CSW3和Pseudomonassp.JP1降解苯并[a]芘的中間產物[24，26]，菲和芘的進一步降解也需要脫氫酶參與。筆者研究中，各處理可能對PAHs降解的中間產物降解有顯著促進作用，其中2#處理促進作用較小，3#處理促進作用較明顯，而4#處理促進作用最大。值得注意的是，3#和4#處理土壤脫氫酶活性在41 d后大幅提高，這說明31 d時添加的菌液在經過適應期后發揮了降解作用，雖然投加的混菌不具備降解土壤殘留難降解PAHs的能力，但對降解中間產物的進一步礦化可能有顯著促進作用。

3 結論

采用微生物修復法處理PAHs污染土壤，通過模擬生物堆實驗運行80 d后，各處理PAHs污染土壤總PAHs降解率均在83%～85%之間，表明添加1 000 mg·kg-1的Tween 80、以30 mL·min-1通風和投加10 mL·kg-1降解混菌的生物堆處理可以應用于PAHs污染場地土壤修復。