微生物燃料電池(MFC)型生物毒性傳感器用于重金屬離子檢測的研究進展

魯 汭，林莉莉，肖恩榮，吳振斌

(1.中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室，湖北 武漢 430072；2.中國科學院大學，北京 100049；3.武漢理工大學資源與環境工程學院，湖北 武漢 430070)

水污染是一個影響發展中國家和發達國家的世界性問題，其中特別是水體重金屬污染，造成每年超過百萬人終身殘疾甚至失去生命[1]。重金屬污染物主要指相對體積質量在4.0以上的金屬及其化合物造成的環境污染，由于其具有毒性大、來源廣、殘留時間長、有積累性和沿食物鏈富集等特點嚴重威脅人類健康[1-3]。通過檢測水環境中重金屬可保障對重金屬污染的監督和治理，是保護環境和提高人民生活水平的關鍵環節。

當前對重金屬的理化分析方法很多，主要有原子熒光光譜法、原子吸收分光光度法和電感耦合等離子體質譜法等[3]。這類方法靈敏度高，檢出限低，如ρ(Cd)可達0.001 ng·m-3，ρ(Zn)達0.04 ng·m-3，但其檢測成本高，操作過程復雜，無法實現實時在線監測，而且不能反映各種有毒物質的綜合效應[4]。生物毒性檢測方法可利用指示生物對重金屬的生理毒理響應，反映水質生態毒性的綜合效應，但這類方法普遍存在靈敏度低、檢測時間長、維護成本高和指示生物保存困難等缺陷[5]。因此，迫切需要開發能實時在線、快速、簡便、靈敏度高、易維護的生物毒性檢測裝置[6]。

近年來，微生物燃料電池(microbial fuel cell，MFC)型生物傳感器以其低成本、操作簡單、能實現污染物在線自動檢測等特點在環境監測方面有著廣泛的應用前景[6-7]。MFC型生物傳感器已逐步應用于水質溶解氧(DO)[8]、生化需氧量(BOD)[9]和化學需氧量(COD)[7,10]等指標的監測。而對重金屬離子的檢測與預警還在研究開發中，MFC型生物傳感器對單一或多種重金屬離子的檢測可能成為未來研究的新趨勢。因此，該文從原理、評價指標和性能影響因素等方面，綜述了近十年MFC型生物毒性傳感器在重金屬離子檢測方面的研究和應用進展，為其逐步應用發展提供支撐和參考。

1 MFC型生物傳感器原理

MFC是在產電微生物的催化作用下將化學能轉化為電能的裝置[11]。MFC通常包含陰、陽兩個極室，中間由質子交換膜(proton exchange membrane，PEM)分隔開，兩極通過含負載的外部電路連接。產電微生物在陽極表面聚集形成生物膜[12]，利用葡萄糖和醋酸等可降解有機物產生二氧化碳、質子和電子；電子直接或間接傳遞至陽極，然后通過外電路到達陰極，質子通過溶液遷移到陰極，并與來自外電路的電子和陰極室的氧氣反應產生水(圖1)。以此為基礎，利用MFC輸出電信號與有機底物濃度呈正比的原理，建立MFC型生物傳感器[13-14]：在干擾MFC產生電流的因素(如溫度、pH和電導率等)保持恒定前提下，當有機底物處于非飽和狀態時，產電微生物的代謝活性隨有機物濃度增加而增強，產生和傳遞到陽極的電子數量也在持續增加[15-16]〔圖2(a)〕。相反，當所有影響因素(包括有機物濃度)保持恒定時，如果進水毒性重金屬(如Cu2+、Cr6+等)濃度達到一定域值，產電微生物內各種酶的活性和呼吸代謝過程受到抑制，電子的產生和傳遞受到阻礙，MFC輸出電信號的衰減與重金屬濃度呈正比[17-18]。根據這一原理，MFC可作為生物毒性傳感器用于檢測水中重金屬〔圖2(b)〕。

2 MFC型生物毒性傳感器性能表征特性因子

若要開發一種新的傳感器，需要了解對某一特定應用的要求以及傳感器應具備的特性，并有助于在設計傳感器時對其特性進行優化。在開發用于傳感目的的MFC技術時，必須滿足一些關鍵特性，保證對監測物質的高靈敏度和監測速度，這些特性有別于用于能量收集的MFC技術。以下介紹幾個主要表征MFC型生物毒性傳感器性能的特性因子。這些特性因子的優化是在設計MFC型生物毒性傳感器時需要著重考慮的。

2.1 電信號

選取合適的電信號和濃度的校正曲線可增強用傳感器檢測重金屬濃度的準確性，MFC產生的電信號種類很多，用于能量收集的MFC關注輸出電信號的大小，而用于傳感目的的MFC則關注輸出電信號的變化，因此在電信號的處理上有所差異。MFC型生物毒性傳感器的分析信號通常指當陽極生物膜暴露于有毒溶液中時，傳感器輸出電荷量(coulombic yield，CY)的凈變化。通過將有毒物質濃度與抑制率(inhibition ratio，IR)關聯建立校正曲線。抑制率(RI)[19]計算公式為

RI=|Qnor-Qtox|/Qnor×100。

(1)

式(1)中，Qnor為沒有向陽極室添加重金屬的MFC型生物毒性傳感器的電荷量，C；Qtox為向陽極添加重金屬后MFC型生物毒性傳感器的電荷量，C。

在一些研究中也有根據電壓信號的變化或電流信號的變化計算抑制率并將其與有毒物質濃度建立校正曲線。如喬軍晶[20]的研究中使用了電壓峰值抑制率(RI,U)，其計算公式為

(2)

式(2)中，Vnor為沒有向陽極添加重金屬的MFC輸出的電壓峰值，V；Vtox為向陽極添加重金屬后MFC輸出的電壓峰值，V。STEIN等[21]使用電流密度作為對重金屬的檢測信號，其抑制率計算方法與以電壓和電荷量作為檢測信號的計算方法相似。

電荷量、電壓和電流都是表達MFC裝置輸出電能性能的參數，但電荷量是一個周期內電子從陽極轉移到陰極的量，而電流和電壓表示MFC輸出電能的瞬時值，所以電荷量的變化代表了時間綜合毒性效應的變化，而電流和電壓信號的變化則代表了毒性反應速率的變化，3種信號需依據具體情境和需要選擇。

2.2 靈敏度

MFC型生物毒性傳感器靈敏度(S)[10]的定義通常指在陽極單位表面積條件下每單位分析物濃度變化所引起的電信號變化，計算公式為

(3)

式(3)中，ΔI為輸出電流的變化，μA；Δc為分析物濃度變化，mmol·L-1；A為陽極表面積，cm2。

MFC型生物毒性傳感器的靈敏度取決于目標毒物的特性[19,21]、產電微生物相互作用的機理[22]和對污染物質的親和力[21]。一般陽極表面積為一定值，ΔI/Δc為輸出電流與分析物濃度曲線的斜率，靈敏度越高、斜率越大的傳感器對重金屬的電信號響應就越顯著，有利于傳感器對水體重金屬濃度變化的實時監測。

2.3 檢測限

當MFC型生物毒性傳感器用于檢測重金屬時，重金屬濃度低于檢測下限時電信號可能不會出現明顯變化，而當重金屬濃度超過檢測上限時將導致輸出電流降至零且無法恢復[22]。由表1[10,19-33]可知，部分MFC型生物毒性傳感器對重金屬的檢測下限低于世界衛生組織公布的水質標準，可作為檢測水環境中重金屬濃度的實時預警裝置。而傳統的生物測定法[5]利用如斑馬魚、發光細菌(VibrioqinghaiensisQ67)和爪蟾胚胎在重金屬環境下的存活率、畸形率和生長抑制率等得到的檢測下限僅達mg·L-1，無法達到要求，其他復雜的分析方法如原子熒光光譜法又過于昂貴、耗時，不適用于在線監測。

2.4 時間因素

2.4.1響應時間

MFC型生物毒性傳感器的響應時間[34]一般指陽極產電微生物對進水中重金屬離子響應并表現在裝置輸出電信號上且校正曲線的相關性為最高時的時間。STEIN等[21]研究發現響應時間與裝置的膜類型和電勢有關，SHEN等[24]研究表明響應時間與水力停留時間和重金屬濃度有關。響應時間是MFC型生物毒性傳感器實現實時在線監測的關鍵因素，如果測定時間太短，生化反應不完全，輸出信號變化則不明顯，會影響測定結果的準確性；如果測定時間太長，則達不到實時測定的時效性目的，不利于實際應用。因此，優化MFC型生物毒性傳感器的響應時間是后續傳感器設計需要考慮的重要方面。

表1 用于檢測重金屬的微生物燃料電池(MFC)型生物毒性傳感器性能參數

2.4.2恢復時間

MFC型生物毒性傳感器的恢復時間[34]一般指裝置在測定完樣品后輸出電流恢復到基線水平所需要的時間。產電微生物快速完全恢復到檢測前狀態是MFC型生物毒性傳感器能夠在線、長期進行重金屬監測的關鍵。理想情況下重金屬引起的微生物活性下降應該是完全可逆的。然而，實際情況是一部分微生物活性下降是可逆的，另一部分微生物活性下降是不可逆的，如硬壁菌和芽孢桿菌對Cu2+的耐性要優于醋酸桿菌、梭菌和芽孢乳桿菌[23]。即使對于活性可逆的微生物，由于時間的限制，可能無法完全恢復到原有水平。為了評估微生物的恢復情況，提出了“恢復程度(degree of recovery)”的術語，定義為裝置輸出信號恢復到基線水平的百分比。恢復程度受到重金屬類型、濃度、陽極生物膜和傳感器操作的影響[24]。

傳統的生物檢測方法如利用隆線溞[35]的趨光行為變化評價Cr6+生物毒性，其檢測時間為3 h，恢復時間取決于該生物的繁殖能力和生命周期，若使用斑馬魚[5]，其檢測時間為48 h，馴養時間(即恢復時間)在7 d以上。所以，對比傳統生物檢測方法，MFC型生物毒性傳感器具有更短的響應時間和更短的恢復時間。而對比傳統的理化分析方法，如使用Metalyser HM1000便攜式重金屬測定儀[6]，其對Cd和Hg的檢測時間僅有10 min，且響應時間也非常短，但其樣品檢測成本高，每個樣品的檢測成本為11.3美元，限制了其推廣應用。所以，比較這兩者發現MFC型生物傳感器具有更大的應用潛力。

3 MFC型生物毒性傳感器性能影響參數

作為一種檢測裝置，MFC型重金屬生物毒性傳感器若要運用于實際工程檢測中，應滿足高靈敏度、快速響應、恢復時間短和較好的線性度等條件。而MFC裝置構型、離子交換膜、電極材料和接種源等參數的變化都有可能影響MFC型生物傳感器的性能。優化MFC型生物毒性傳感器能更好地推進其在環境監測領域的發展。近十年MFC型生物毒性傳感器對重金屬的檢測研究總結見表1。

3.1 MFC構型

從MFC的組裝和結構上可以將MFC分為單室、雙室和“三合一”3種構型[11,36]。

傳統的雙室MFC[15,18]主要由陽極室、陰極室和質子交換膜組成，樣品進入陽極室，陽極生物膜作為敏感元件對重金屬做出響應，陰極室一般需要連續曝氣為陰極提供足夠的氧氣作為電子受體。傳統雙室MFC裝置在實驗室中易于搭建，在小試和中試中得到廣泛使用，但其體積較大，操作和結構復雜，較大的電極間距導致MFC內阻增高，在實際應用中各項參數也不易控制，此外所用的質子交換膜價格昂貴，所以不利于實際應用推廣。

單室MFC[16-17]的陽極和陰極在同一反應室，樣品進入反應室與陽極生物膜接觸，陰極和質子交換膜壓合省去了陰極室，利用空氣中的氧氣作為陰極電子受體。單室MFC體積小，便于攜帶，電極間距也相應減小，提高了MFC的輸出功率。盡管如此，如表1所示，單室MFC體積縮小有限，一般為20～150 mL[36]，難以直接安裝在廢水處理設備上，且較大體積的MFC所含大量廢水可能導致內阻不穩定，增加產生故障信號的可能性。

“三合一”型MFC如紙基MFC(paper-based microbial fuel cell)[37]將碳布和紙基質子交換膜一起壓合，利用碳布的兩面分別作為陰、陽極，將MFC體積從毫升級減小到微升級，同時陽極體積也減小，陽極上的微生物量更低，相應所需的接種馴化時間更短。FRAIWAN等[37]的試驗中將紙基MFC放入待測樣品中，立即就能產生電流，不像傳統MFC陽極需要幾天到幾周的微生物積累和馴化時間，解決了傳統MFC傳感器存在的馴化時間較長的問題。但在實際應用中鐵氰化鉀并不適合作為陰極電子受體，且紙基MFC的機械強度低，遇水后易出現破漏，影響現場監測。而另外一種“三合一”型MFC通過堆疊2個沒有質子交換膜和紙基的扁平過濾膜開發出一種簡單的微流體MFC(flat microliter membrane-based microbial fuel cell)傳感器[32]，使用刷子在濾膜上畫出多條碳墨線，以有效地轉移膜上微生物產生的電子，整體厚度小于2 mm，在裝置組裝前將陽極膜置于單室MFC中進行接種和掛膜3 h，組裝完成后其能對Cr6+和Ni2+的沖擊做出快速響應。

MFC傳感器構型多樣，但需要與其他水質傳感器聯用，實現實時在線監測，MFC裝置結構的微型化、集成化和智能化是必不可少的，也是未來MFC傳感器構型發展的趨勢。

3.2 MFC離子交換膜

離子交換膜[11]是MFC的重要組成部分，它不僅是一種隔膜材料，也作為一種選擇性透過膜，起著傳導質子、分隔氧化劑和還原劑的作用。離子交換膜類型很多，如：陽離子交換膜、陰離子交換膜、一價選擇性陽離子交換膜和雙極膜等。在進行MFC裝置設計時，需要考慮不同類型離子交換膜對傳感器檢測重金屬的影響。

當采用MFC型生物毒性傳感器檢測重金屬時，含重金屬的廢水進入MFC陽極室，會向陽極生物膜擴散，此部分向陽極生物膜擴散的重金屬濃度通過輸出的電信號被檢測到。除此之外，由于大部分MFC傳感器都使用陽離子交換膜，帶正電荷的重金屬離子可能會通過膜向陰極室遷移擴散。此外，在陽離子交換膜中發生的離子交換可以使帶正電荷的重金屬離子在膜中被吸收。重金屬離子向陰極和質子交換膜上的擴散可能長期降低陽極室和生物膜中重金屬離子濃度，影響了MFC型生物傳感器對進水中重金屬濃度的準確響應。因此，選擇合適的離子交換膜，減少重金屬離子從陽極室流向膜和陰極室的量，從而增加生物膜中重金屬濃度，使生物膜中微生物代謝活動受抑制更顯著，靈敏度更大，檢測下限更低，檢測誤差更小，有利于MFC傳感器對重金屬沖擊的響應。

傳統MFC中，陽離子交換膜得到廣泛使用，其他類型離子交換膜，包括陰離子交換膜、一價選擇性陽離子交換膜和雙極膜也有使用。STEIN等[21]以金屬鎳為例測試了這4種膜對MFC生物毒性傳感器的影響，結果表明離子交換膜的改變對傳感器靈敏度的影響不顯著。常定明[30]通過對MFC中鎳離子的分布與去除機理的研究發現，75.56%的鎳在陽極被沉淀去除，15.04%的鎳在陰極被沉淀去除，只有不到1%的鎳分布在陽離子交換膜上。與鎳離子相似，發現61.77%的銅以固體形式沉積在陽極室和玻璃器壁上，37.77%的銅被吸附在陽極生物膜上，只有0.33%的銅吸附在陽離子交換膜上，極少量銅遷移到陰極。這也說明陽離子交換膜對金屬鎳、銅離子的影響是有限的。其他重金屬離子對離子交換膜的影響是否與鎳離子和銅離子相似有待進一步研究。

3.3 MFC電極材料

同其他燃料電池相比，MFC電極材料原料來源廣泛，可使用的電極材料種類繁多，因此也降低了MFC型生物毒性傳感器的制作成本。選取合適的電極材料可以降低MFC的內阻，避免重金屬在電極的富集，提高傳感器的靈敏度、響應時間和準確性。

MFC陽極材料應具有耐腐蝕、電導率高、比表面積大和不易堵塞等特點。當前MFC陽極常用的電極材料有碳布、石墨棒和石墨氈等[25,27]。但普通石墨電極的電導率、功率密度和微生物富集量有限，因此在普通石墨電極的基礎上，進行化學修飾制作出如鉑/石墨電極、穿孔鉑/石墨電極和錳修飾針織石墨電極等，提高MFC性能。PARK等[38]的研究中討論了使用Mn4+修飾石墨和中性紅共價鍵連接的編織石墨作為陽極的單室MFC產電性能，結果表明通過將電子介體摻入石墨電極中可以將傳統石墨電極的產電能力增加1 000倍。此外，通過碳材料的改性、導電聚合物與碳納米管復合等方法，可加工成各種形狀和尺寸，形成如鈦絲/聚丙烯腈碳纖維絞合碳刷陽極[22]，增加陽極電導率。LI等[39]的研究顯示，在MFC對重金屬廢水處理過程中，Fe3+和Cr6+的氧化還原電位高于MFC陽極的工作電位，重金屬將沉積在陽極表面，增大了檢測誤差。重金屬離子在陽極發生的非生物化學反應對MFC毒性監測的影響以及解決辦法有待進一步研究。此外，對避免重金屬富集的陽極材料的研發也是未來的研究方向。

陰極性能是影響MFC性能的重要因素。陽極遷移來的質子與電子受體在陰極發生還原反應。陰極材料應具有較好的還原催化性、來源廣泛和價格低廉等特點。近些年，多采用碳布、石墨和碳紙[32]等基礎材料，再通過附載高活性催化劑如鉑、PbO2、四甲氧基苯基鈷卟啉和酞菁鐵等增加其還原催化性[40-41]。另外，以好氧微生物為催化劑的生物陰極以其可應用性和可持續性在MFC中得到廣泛運用[42]。但在MFC傳感器對重金屬離子的監測中，擴散至陽極的金屬離子作為電子受體，在陰極被還原，可能造成陰極催化劑中毒，增大檢測誤差，因而重金屬對MFC傳感器陰極的影響有待探究。

3.4 MFC控制模式

常用的外電路連接方式有3種[14]：一是固定外部電阻(external resistance，ER)并記錄電阻兩端的電壓；二是利用恒電位器保持陽極生物膜上的恒定電位(constant potential，CP)，并測量產生的電流；三是在MFC上施加外部電壓(external voltage，EV)來克服MFC內阻，從而提高電信號輸出。控制模式的選擇影響著傳感器的監測性能，在設計傳感器時應對其進行優化。

傳統的MFC一般使用外電阻連接方式，其成本低，操作簡單。但使用外電阻方式連接時電信號同時受到陽極和陰極條件的影響，在檢測過程中很難保持陽極電勢恒定。而陽極微生物從陽極過電位獲得能量，陽極電勢的變化將影響微生物生長，導致電信號波動，影響檢測的穩定性和準確性。因此，需要控制陽極過電位以防止在檢測重金屬時出現誤報。所以使用恒定電位的控制方式，可以保持基線電流的穩定，相比外阻連接方式具有更高的靈敏度[28-29]。但使用恒電位器則需使用參比電極，增加了成本且無法實現自供能監測。除此之外，在一些研究中也會使用恒電流儀代替恒電位儀，保持MFC傳感器的電流恒定，然后分析所記錄的MFC電壓或陽極電位信號[33]。施加外部電壓的控制方式在MFC中也有使用，如JIN等[43]在雙室MFC上通過外加電壓方式縮短了MFC傳感器的響應時間。

3.5 MFC微生物

MFC中產電微生物菌群豐富，接種來源廣泛。主要使用污水處理廠活性污泥、河道沉積物、土壤、海水沉積物和MFC裝置出水等進行產電微生物接種。主要的產電微生物[12,44]有土桿菌屬、希瓦氏菌屬、紅育菌屬和假單胞菌屬等。此外，也有使用單一菌種嗜鉻色桿菌YC152[31]為MFC進行接種，對Cr6+進行檢測。

傳統MFC中產電微生物可能會在重金屬的脅迫下失去產電能力，而用于重金屬監測的MFC產電微生物應對重金屬具有一定的耐受性，其產電能力僅在短時間內被抑制，而在無重金屬脅迫下其產電能力可快速恢復。根據LOGAN[12]和LOVLEY[44]對現有產電微生物的介紹和黨政等[45]關于微生物對重金屬的響應，歸納出可能用于MFC型生物傳感器的產電微生物菌屬(表2[31,46-52])。

表2 重金屬耐受性產電微生物菌屬

目前，關于MFC生物毒性傳感器中產電微生物的研究鮮有報道。不同重金屬對產電微生物的抑制程度不一。YU等[26]的研究表明Hg2+> Cu2+> Cd2+> Zn2+> Pb2+> Cr3+；而在YI等[25]的研究中為Cd2+>Ni2+>Cu2+，這可能與裝置結構和金屬濃度有關。這一結果也表明微生物對不同重金屬的響應具有特異性，可用于特定重金屬的監測。但也可能存在著長時間監測所引起的陽極微生物對重金屬的適應性增強的問題，最終導致傳感器靈敏度降低。林稚蘭等[53]關于微生物對重金屬的抗性研究中發現丁香假單胞菌中CopC和CopB編碼蛋白具有抗銅活性，在真養產堿桿菌中發現czcCBAD系統基因對Co2+、Zn2+和Cd2+具有拮抗作用。可見，當陽極產電微生物長期暴露于含重金屬的溶液中時，含有拮抗重金屬基因的微生物將逐漸成為優勢菌。不同的微生物接種源也影響著對重金屬的監測效果，PATIL等[27]研究中分別使用初沉池中的生物膜態(biofilm)微生物和懸浮態(planktonic)微生物接種于MFC陽極，結果顯示與生物膜態產電微生物相比，同源的懸浮態產電微生物受抗生素的影響更大。這一現象可能也存在于對重金屬的檢測中。當前對MFC型生物毒性傳感器在重金屬的檢測中陽極微生物群落結構的變化研究有限，可通過進一步研究以拓展MFC型生物毒性傳感器的理論基礎。此外，可探討產電微生物種類和形態對不同重金屬離子的產電響應。未來篩選出對重金屬具有特異性、靈敏度更高和恢復時間更短的菌種也是重要的研究方向。

4 結論和展望

MFC型生物毒性傳感器作為一種新型可實時在線檢測裝置得到了越來越多的關注，雖然取得了一定的研究進展，但離實際應用還有很大差距，其未來發展和研究方向將與電極材料、專性指示微生物以及通信技術等方面密切相關。未來MFC型生物毒性傳感器可能的研究方向：(1)篩選出具有特異性、靈敏度高、恢復速度快的陽極產電微生物菌種，實現對某一特定重金屬離子的檢測。(2)結合新型材料工藝的發展，開展MFC型生物毒性傳感器的集成化和裝置體積的微小化研究。(3)結合5G技術，研究MFC型生物毒性傳感器的遠程在線實時監測及智能化擴展應用。