慢性支氣管炎動物模型的研究進展*

崔 爽 張明倩 梁五林 張碩峰

(北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488)

慢性支氣管炎(chronic bronchitis，CB)是一種十分常見的慢性炎癥，集中發作于氣管、支氣管黏膜及周圍組織。病程初期表現較緩和，冬季發病較頻繁而待春天回溫后情況轉好，以每年發病至少三個月，持續表現兩年或更長時間為特征。晚期一般表現為病情加重，癥狀常年存在[1-2]，進而發展為慢性阻塞性肺疾病(COPD)。CB表現為呼吸道的感染，與吸煙、理化因素(如：二氧化硫、氯氣、刺激性煙霧等)及感染因素(如細菌、病毒等)相關，還涉及年齡、環境等因素。此外，由免疫因素[3]引起的支氣管黏膜充血水腫和壞死、纖毛無法正常運動、功能亢進等持續炎癥與CB的發生也有密切的關系。

現階段，通過實施藥物干預以減輕CB感染程度進而減輕癥狀已成為研發相關藥物的關鍵。選用模型動物并選擇性排除干擾因素能夠更直觀地了解其發病因素、病理特征和發病機制，對后期的臨床研究及新藥的開發提供重要材料。考慮到實驗動物的繁殖周期、實驗成本、動物基因組研究進程等多種因素，大鼠、小鼠[4]、豚鼠等廣泛應用于復制CB模型。根據誘發CB模型的方法，歸納總結如下。

1 煙熏法

煙熏法是模擬人類吸煙對呼吸道的刺激，引發CB的病理過程的一種造模方法。由于煙草形成的煙霧中含有焦油、氫氰酸、菸堿、尼古丁等多種化學物質，可嚴重損傷實驗動物的呼吸道的防御屏障，導致呼吸道黏液分泌增多、纖毛運動受阻引起痰液增多；同時支氣管痙攣，氣道阻力增加造成通氣障礙；氣管黏膜損傷、氣道重塑，引起氣道順應性下降，最終導致CB的病理變化[5]。本方法的優點是簡便易行，較接近臨床實際，能夠更好的模擬CB的發病過程，故成為CB最常用的造模方法。缺點是(1)成模時間長；(2)致煙劑原料的成分和種類以及煙霧濃度難以控制，加之煙熏時長和頻率的不同，導致不同實驗室所復制的模型動物的病理反應輕重不一致；(3)本方法在實施過程中對環境污染較大，難以實施。

煙熏法多以單一煙絲或混合煙霧材料[6](如煙葉、鋸末、刨花各50 g)為刺激物置于特制煙室制備CB模型。目前，多采用大鼠或小鼠作為實驗動物，30～50 min/次，2～4次/d，持續28～60 d。結果顯示模型組小鼠氣道上皮出現大量炎細胞浸潤，腺體分泌功能亢進，有黏液栓形成，肺泡灌洗液中白細胞總數和中性粒細胞數量明顯增加，蛋白含量上調，血漿和肺組織勻漿的超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力降低，丙二醛(MDA)含量增加。其成模機制可能與氧化應激過強有關[7]。魏星等[6]得出模型組大鼠CB形成呈現漸進性發展過程，表現為口鼻腔黏膜色澤紫紅、分泌物較多及咳嗽喘息程度加重，其病理形態學表現為肺泡壁變薄、黏膜杯狀細胞增生以及炎性細胞浸潤。劉延禎等[8]發現CB大鼠肺組織中白介素-2(IL-2)含量明顯降低，白介素-8(IL-8)含量明顯升高，表明趨化炎性細胞和釋放炎性因子可引發炎癥反應[9-10]。衛智權等[11]分析得模型組大鼠單核細胞NF-κB(P65)與IκBα的動態平衡失衡引起病理性損傷，其體內外周血單個核細胞(PBMC)大量募集并激活，產生大量腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超敏C反應蛋白(hs-CRP)、IL-6[12]等炎癥細胞因子。由于PBMC的IκBα表達水平未出現相應提升，使PBMC的NF-κB(P65)持續激活造成炎癥持續損傷而慢性化。同時，肺組織超氧化物歧化酶1(SOD1)、SOD2、SOD3、IL-2、IL-4及其基因表達下調，白介素-1(IL-1)、TNF-N及MDA水平提高，CD4+T淋巴細胞比例上調，肺組織HE染色病理表現為明顯的慢支特征[13-14]。

煙熏法致CB模型的建立呈漸進性發展，優點是簡便可靠，炎癥病變確切，有助于研究CB發生發展過程中各階段的病理變化以及相應炎細胞浸潤及炎性標志物的變化，為臨床早期診斷和治療提供理論依據。缺點是致煙劑原料種類單一，其燃燒產生的煙霧濃度難以控制，且實驗周期較長，穩定性較差[15]。

2 化學藥物法

多種化學藥物能夠引發CB，常見的藥物有二氧化硫、氯氣、氨水和脂多糖(LPS)。此外，酶、硝酸、氯化鎘、二氧化氮、膽堿能藥物、促分泌素等物質也對支氣管造成一定的損傷進而引發炎癥。優點是簡便易行、快速可靠且藥物劑量可控，缺點為各藥物對氣道損傷的病因不同，具體反應部位以及程度也有差異。

2.1 二氧化硫吸入法

二氧化硫吸入法多采用大鼠及小鼠作為實驗對象，將不同濃度的二氧化硫置于玻璃鐘罩或者特制熏箱，將實驗動物分批放入進行10 s～30 min熏制，1次/d，全程15～28 d[16-18]。

楊帆等[16]發現模型組小鼠體質量明顯減輕，肺氣管組織病變明顯，各級支氣管都可見黏液栓，咳嗽次數顯著增加，黏膜組織杯狀細胞增生和淋巴細胞、漿細胞等大量炎癥細胞浸潤。白旭華等[17]得出模型組小鼠支氣管管壁部分上皮變性脫落，局部出現鱗狀上皮化生，氣管和支氣管黏膜杯狀細胞大量增生。尹永芹等[18]分析得出模型組大鼠出現哮鳴及呼吸困難，支氣管黏膜浸潤程度加重且導致上皮細胞明顯脫落，肺泡腔出現氣腫改變，肺泡壁有間質炎，肺組織勻漿TNF-α水平顯著上調, 而IL-10和IL-4水平則顯著下調(P<0.01)。

本方法能夠引起CB的病理變化，病情發展嚴重后甚至導致氣流阻塞并發肺氣腫。本方法快速簡易，但對氣管及支氣管的刺激性較大，過量的二氧化硫會引起呼吸道黏膜燒灼傷，上皮細胞增生壞死，容易導致動物模型發生急性損傷甚至死亡，故選用合適的濃度以及建立過程，使氣道損傷程度適中尤為重要。

2.2 氨水霧化法

因小鼠對于氨水的敏感性更高，伴有明顯的腹肌收縮或縮胸, 同時張大嘴, 伴有咳嗽聲等表現，故氨水霧化法多采用小鼠作為實驗對象。侯穎等[19]采用氨水霧化引咳以制備小鼠CB模型，2 min/次，每次間隔0.5 h，5次/d，連續10 d，10 d后采用氨水霧化2 min/次，每次間隔0.5 h，2次/d，連續20 d，全程總共30 d。模型組咳嗽次數明顯增加、支氣管黏膜上皮細胞空泡變性增生、細支氣管皺縮、炎性細胞浸潤、纖毛發生倒伏脫失、部分肺泡隔斷裂成肺大泡、管腔大量漿液滲出及肺間質血管擴張淤血。本方法簡便易行，但在實施過程中污染較大。

2.3 氯氣吸入法

暴露于低濃度的氯會優先對大呼吸道造成損害，而對肺泡損害較弱，從而造成廣泛氣道損害。高濃度的氯(800 g/m3、5 min)會直接導致呼吸道和肺泡雙重損傷進而導致急性氣道炎癥反應的發生。由于氧化應激標志物的發現以及低分子量抗氧化劑對異常情況的緩解，進而證明氯氣對氣道造成的損害本質上是氧化性的[20]。

2.4 LPS注射法

LPS是蛋白質、類脂質及多糖的復合物，也是重要的致炎因子，可引起氣道上皮損傷，激活炎性細胞并釋放炎性因子，誘導氣道炎癥。本方法多采用小鼠或大鼠作為實驗對象，采用氣管滴注等方法制備CB動物模型。

馬楠等[21]得出模型組大鼠肺組織表面無液體滲出及出血，呈灰白膨脹狀態，支氣管平滑肌增厚，部分纖毛上皮細胞變性脫落、連接間隙增寬，復合纖毛生成、管壁可見慢性炎細胞浸潤、杯狀細胞增生及管腔內充滿以中性粒細胞為主的炎細胞以及黏液。曹強等[22]通過對肺灌洗液的成分分析得出，模型組MDA、乳酸脫氫酶(LDH)、白蛋白(ALB)、谷胱甘肽(GSH)和堿性磷酸酶(AKP)5個指標的含量均有所上調，巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數量顯著增加。CD11c/CD18和CD14作為細菌脂多糖受體可參與激活巨噬細胞, 前者可直接與LPS結合，而后者需在LPS的刺激下借助血清蛋白尤其是脂多糖結合蛋白(LBP)與CD11c/CD18結合成復合體，由此可通過膜上CD11b/CD18介導細胞從而進行進一步活化，干擾TNF-α、IL-1、IL-10、TGF-β1等細胞因子的釋放，肺泡巨噬細胞胞漿游離鈣也升高，引起CB的氣道炎癥。

本方法簡單經濟、易定量、耗時短且污染較少。由于LPS注射法具有足夠的刺激強度，同時又考慮到人類CB的發病機制，故可成功復制出CB的動物模型。其缺點是LPS過量會導致急性肺損傷改變，不利于CB的階段性觀察，故前期造模條件的摸索尤為重要[5]。

2.5 甲醛刺激法

葉根荃等[23]選用20%的甲醛(10 mL)刺激模型組小鼠1 h，連續刺激30 d的方法復制CB模型。自第10天起，該模型中小鼠的氣管及支氣管黏膜出現輕度充血水腫、杯狀細胞輕微增生、炎性細胞浸潤及肺間質輕度充血。隨造模時間延長，小鼠體質量日益減輕，同時炎癥逐漸加重。自20 d起，部分上皮鱗狀化生明顯，較大支氣管出現不同程度的炎性細胞浸潤。直至第30 d，黏膜充血明顯，中、小支氣管黏膜上皮細胞出現灶性變性壞死、脫落，杯狀細胞大量增生，大量黏液分泌及分泌物增加。本方法優點是裝置和操作簡單，成本較低，實際應用較為方便。缺點為甲醛易揮發，污染環境。

3 復合刺激法

由于動物與人類在解剖學、炎癥或纖維化的嚴重程度上的差異，或是動物炎癥模型缺乏對實驗方案和實驗條件的完整病理現象，故單因素的造模方法不能完全模擬人類CB的病理改變。所以，采用多因素刺激方法即復合刺激法可以更好的建立符合人類CB病理改變特點的CB動物模型[24]。同時，也有助于推進新型CB動物模型的開發與應用。

3.1 氣管內注射LPS聯合煙熏法[25-26]

氣管內注射LPS聯合煙熏法多以小鼠和大鼠作為實驗對象，以香煙或混合煙霧材料與LPS交替或者重疊刺激的方式復制CB模型[27-28]。王瑛[29]發現模型組大鼠表現為毛發凌亂無光澤及氣喘氣促，28 d后體質量明顯下降，支氣管管壁炎癥細胞大量浸潤、肺泡壁出現明顯水腫、支氣管平滑肌增厚斷裂、杯狀細胞增生且部分氣道黏膜上皮纖毛黏連及脫落。潘朝旺等[30]發現模型組大鼠血清TNF-α、IL-13和IL-8含量均上調。凌嫘等[31]發現前炎癥因子TNF-α受到理化等刺激后持續釋放至血液以及組織，激活p38 MAPK通路參與中性粒細胞的信號傳導，加劇炎癥細胞的聚集，從而加重炎癥反應以至于呼吸道感染反復發作。在氣管內注射LPS聯合煙熏法中，其優點為所需時間相對較少，但操作較復雜，實驗過程中存在一定死亡率[32]。

3.2 LPS聯合卡介苗法

郭磊等[33]采用5 mg卡介苗(尾靜脈注射)聯合200 μg LPS(氣管插管)的方法，持續三周后成功復制大鼠CB模型。模型組，肺組織勻漿TNF-α和IL-8水平顯著上調，而IL-10水平下調[34]。支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細胞計數、中性粒細胞以及肺泡巨噬細胞比例顯著升高。同時，肺泡巨噬細胞一氧化氮含量及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的活性均表現出明顯的提高(P<0.05)。本方法較獨用LPS更為典型，但很難復制出氣管腺體增生的形態學改變，可能是大鼠氣管與支氣管腺體不發達之故[35]。

3.3 氣管滴入LPS聯合肺炎克雷伯桿菌反復感染法

趙春貞等[36]選用雄性SD大鼠用靜脈套管針注射肺炎克雷伯桿菌菌液(0.1 mL), 2次/周, 每滴入該菌液三次后, 采取相同的方法注射0.1 mL的LPS(200 μg)，以此循環直到12周后復制出大鼠CB模型。模型組BALF中白細胞總數明顯增多，炎癥細胞浸潤、肺泡明顯擴張、杯狀細胞數明顯增多、肺泡壁變薄并存在部分撕裂、肺組織勻漿MDA含量上調且支氣管和肺泡上皮細胞內核轉錄因子E2相關因子(Nrf2)蛋白表達明顯增多。本方法為細菌感染在相關肺部疾病的作用提供相應的數據支持，其病理特征與人體相符，具有重要的應用價值。

3.4 注入LPS聯合被動吸煙及二氧化硫吸入法

杜秀婷等[37]采用4周齡KM小鼠在實驗的第1、14天分別經鼻腔和經氣管注入LPS，其余天數選用二氧化硫吸入聯合被動吸煙的方法進行CB模型的制備，總計30 d。復合組小鼠體毛干枯無光澤、體質量增加緩慢、氣道內分泌物增多、管壁有明顯的炎性細胞浸潤、白細胞總數顯著增高(P<0.01)且出現明顯的腔內炎性滲出。本方法準確可靠，針對CB發病學、組織病理學、BALF細胞學等方面分析，LPS、煙熏和二氧化硫聯合造模更符合CB模型的建立。

3.5 LPS聯合煙熏疊加18%低氧法

蔣明等[38]將Wistar大鼠氣管內注入LPS 200 μg，共計2次(第1、14天)；煙熏2 h/d，共計6周，第5、6周采用煙熏疊加18%低氧，8 h/d，6 d/周。模型組炎性細胞浸潤、RVSP和mPAP值上調明顯、肺泡間隔可見淤血、管腔中以中性粒細胞為主的白細胞數量大幅度增加且部分可見上皮麟狀化生。本方法大鼠氣道、肺組織改變更加符合人類CB及肺氣腫的病理改變特點，為臨床的病例診斷和治療提供相關思路。

3.6 LPS聯合寒冷刺激和煙霧吸入法

劉榮強等[39]采用LPS注入聯合寒冷刺激加煙霧吸入的方法建立大鼠CB模型。方法如下：分別在第1、14天將200 μg LPS溶液(1 μg/μL)注入氣管后旋轉大鼠使LPS在肺部分布均勻，其余每天煙熏兩次，每次點燃10支香煙熏30 min，兩次煙熏間隔4 h，末次煙熏后對模型動物進行寒冷刺激，12 h/d，共計30 d。結果顯示，CB組大鼠出現萎靡現象、鼻部有白色或黃色分泌物、肺組織出現氣道損傷和炎癥細胞浸潤、其血清IL-2和IL-4表達明顯上調(P<0.05)及肺組織和支氣管AQP-1表達下調(P<0.05)。通過疊加多種因素建立大鼠CB模型能夠揚長避短，設計更為全面，方法簡單易操作。

4 結果與討論

CB模型的成功建立與否可通過肺功能指標、BALF細胞學指標、組織病理學特征等方面來進行評價，多表現為實驗動物氣道阻力的增加和肺順應性的下降；肺組織出現炎細胞浸潤、肺泡塌陷，肺泡間隔增厚和肺出血等；氣道上皮杯狀細胞化生；BALF中白細胞總數、中性粒細胞以及巨噬細胞數量增加等癥狀，其機制可能與炎癥反應、黏液高分泌、氣道重塑等有關。目前建立CB動物模型的方法種類繁多，每種方法各有其優缺點。煙熏法簡單易行，其他合并疾病出現概率少，但成模時間長且不易復制、難以標準化操作；化學藥物法快速可靠，藥物劑量可控，但所需設備和操作復雜，各藥物所造成的病理機制也有不同，對于二氧化硫、氯氣等有毒氣體，吸入后會造成嚴重的呼吸道黏膜燒灼傷，故調整氣體濃度和實驗條件最為關鍵；LPS注射法可復制性強，具有足夠的刺激強度，病理變化表現穩定且組內差異小，是目前較為流行的致病藥物，但由于其本身具有一定毒性，實行過程中應注意給藥方法；復合刺激法彌補了部分單因素致病建模方法的局限性，完善實驗方案和實驗條件的病理現象，建立更符合人類CB病理改變特點的模型。

5 問題與展望

由于實驗動物與人類的氣道存在解剖學、炎癥或纖維化上的差異，上述造模方法皆不能完全模擬CB病理特點, 需在造模方法、試劑用量以及頻率等方面反復推敲，對比并分析各方法結果的差異，不斷完善CB模型的研究，同時對于其他新型造模方法的建立進行進一步的研究和探索。此外，針對模型動物種類的選擇也十分關鍵，豚鼠易致敏且價格較高, 缺少相關的蛋白質抗體和分子學研究工具；大鼠氣管腺體不發達，對于氣管腺體增生的形態學表現并不明顯；大型動物實驗數量較少且存在倫理問題, 實際應用的可能更小。雖然動物模型的病理過程和臨床特征與人不完全一致，但其可以作為一種良好的實驗室工具進行評估，大鼠基因組與人的基因組序列較為相似，且大鼠的繁殖速度、生命周期較為合適, 能夠縮短研究周期并提高造模結果的準確性，幫助了解CB的病理特點和發展進程，從而產生潛在的干預措施以進行有效地控制。同時，CB模型的探索也有助于防治藥物的進一步探索研究，對臨床研究具有十分重要的意義。