病理學(xué)在人類疾病實驗動物模型評價中的作用和意義*

楊利峰 趙德明

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193)

疾病動物模型是在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中所建立的具有人類或動物疾病模擬性表現(xiàn)的實驗動物。實驗動物疾病模型是生命科學(xué)研究進行的基礎(chǔ)。然而，模型是否構(gòu)建成功，需從行為表現(xiàn)、臨床癥狀、體征指標、血液、生化指標、病理學(xué)指標等多方面進行綜合評價。其中，出現(xiàn)明顯的特征性病理學(xué)變化是重要的評價指標之一。病理學(xué)是關(guān)于疾病的一門醫(yī)學(xué)學(xué)科和專業(yè)實踐學(xué)科，主要研究疾病的本質(zhì)、發(fā)病原因和發(fā)展過程中結(jié)構(gòu)和功能的變化。病理學(xué)評價能夠提供準確、客觀及全面的反應(yīng)造模條件引起實驗動物的病理變化，對實驗動物模型的開發(fā)、相關(guān)實驗設(shè)計、藥效、藥物安全性評價等至關(guān)重要。

1 人類疾病實驗動物模型的分類

人類疾病實驗動物模型，即為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及藥學(xué)研究而建立的具有人類疾病模擬表現(xiàn)的動物實驗對象。根據(jù)產(chǎn)生原因，可將人類疾病實驗動物模型分為以下4類。(1)自發(fā)性動物模型：實驗動物未經(jīng)任何有意識的人工處置，在自然情況下發(fā)生疾病。一般通過培育近交系和發(fā)現(xiàn)突變系來獲得。自發(fā)性動物模型以腫瘤和遺傳疾病居多，如無胸腺裸鼠、自發(fā)性高血壓大鼠、青光眼兔等[1]；(2)誘發(fā)性動物模型：通過物理、化學(xué)、生物致病因素或復(fù)合致病因素人工誘發(fā)的實驗動物。例如，溫度、放射線照射、噪音刺激等物理因素引起實驗動物發(fā)生疾病；給易感動物接種細菌、病毒等生物致病因素以誘發(fā)傳染病；化學(xué)致癌劑誘發(fā)腫瘤等[2]；(3)遺傳修飾動物模型：使用基因組編輯技術(shù)，人為地修飾、改變或干預(yù)生物原有基因組的遺傳組成，并能產(chǎn)生穩(wěn)定有效遺傳的新品系實驗動物。根據(jù)基因修飾的方式可分為轉(zhuǎn)基因模型、基因敲除模型、基因敲入模型、基因敲減模型等[3-4]。例如，Bao等[5]和Jiang等[6]報道，hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠能夠表達人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(hACE2)，使得SARS-CoV-2能夠以其作為受體進入小鼠細胞，為新型冠狀肺炎(COVID-19)致病機理、治療方法的研究及疫苗的開發(fā)提供模型基礎(chǔ)；APP/tau雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型及APP/tau/PS1三轉(zhuǎn)基因模型，能夠較好的復(fù)制阿爾茲海默癥的病理特征[7]；根據(jù)Kersten[8]報道，已有數(shù)百種基因修飾腫瘤模型應(yīng)用于人類腫瘤發(fā)病機制研究及藥物研發(fā)；(4)特色動物模型：具有某些異于其他動物特征的動物品系或品種。例如，東方田鼠具有抵抗血吸蟲的特性，可將其用于血吸蟲病發(fā)病機制的研究[9]。裸鼴鼠不患癌癥的特征使其可以用于抗癌機制的深入研究[10]。長爪沙鼠具有腦血管變異缺失的解剖學(xué)特性，是腦缺血研究良好的模型動物，且對多種病原易感，相比于其他嚙齒類實驗動物，長爪沙鼠受某些病原感染可表現(xiàn)出與人類更相似的病理學(xué)特征和臨床癥狀[11]。

在構(gòu)建實驗動物模型時需遵循相似性、可重復(fù)性、可靠性、適用性、可控性、易行性和經(jīng)濟性原則，謹慎且精準地進行設(shè)計及操作，以確保獲得理想的實驗動物模型。

2 人類疾病實驗動物模型評價體系的構(gòu)成和缺陷

在科學(xué)研究中，研究成果的質(zhì)量及可重復(fù)性備受科研人員的關(guān)注。由于之前臨床前動物研究在投入臨床后，并未復(fù)制出理想的結(jié)果，導(dǎo)致臨床前和臨床結(jié)果之間缺乏一致性，所以近幾年科研人員開始重視從臨床前動物模型中所獲得數(shù)據(jù)的可重復(fù)性和質(zhì)量[12-13]。因此，動物模型的成功構(gòu)建至關(guān)重要。實驗動物模型評價體系是依據(jù)動物模型構(gòu)建的信度和效度(表觀效度、預(yù)測效度以及結(jié)構(gòu)效度)，基于模型制作原理和方法，結(jié)合不同品系動物的特點，對動物模型從整體、組織、細胞和分子水平進行鑒定和評價。實驗動物模型評價體系的制定與實施，是我國醫(yī)藥衛(wèi)生健康產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的重要保障。然而，目前動物模型的評價體系還很不完善，直接影響模型的嚴謹性、可重復(fù)性等，而病理學(xué)在建模過程中，可以對動物的表型鑒定、成模條件等給予重要建議甚至是決定性的結(jié)論，因此成為動物模型評價的關(guān)鍵指標。

如CRISPR和類似的基因編輯技術(shù)被認為是多種疾病潛在的治療方法，這些疾病包括單基因疾病(如囊性纖維化)、代謝性疾病(如2型糖尿病)、癌癥(如黑色素瘤)、感染性疾病、感染性休克、神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默病)等。然而，在這項技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用中，人們對脫靶效應(yīng)、安全性、在使用這些工具時選擇適當(dāng)?shù)目刂拼胧┑葐栴}尤為關(guān)注。雖然基因編輯工具通常被描述為對其目標“特異”，但不少研究報道了提高特異性的新方法，這也提出了關(guān)于如何徹底評估脫靶效應(yīng)的問題。病理學(xué)在評估基因編輯的安全性、目標特異性、篩選脫靶效應(yīng)等方面可提供有效的指導(dǎo)[14]。突如其來的COVID-19疫情給人類帶來了全球性的災(zāi)難，其強大的傳播能力和致命的不良后果，給醫(yī)學(xué)科技帶來了巨大的考驗與挑戰(zhàn)。如何能夠在短時間內(nèi)篩選出安全、有效的藥物和疫苗，及時挽救人類生命，防控疾病流行，COVID-19的實驗動物模型則在其中扮演“關(guān)鍵角色”及擔(dān)當(dāng)“重要使命”。然而，造模的動物可否表現(xiàn)與人類相近的呼吸窘迫癥；是否能表現(xiàn)間質(zhì)性肺炎的特征性病理變化；感染后病毒的定位及分布情況；除肺臟以外，是否發(fā)生其他臟器的損傷。以上問題，只有通過病理學(xué)技術(shù)才能直觀且明確的解釋。病理學(xué)技術(shù)為揭示疾病的致病機制，評價疫苗及藥物的安全性、有效性等提供必備基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和重要技術(shù)保障。

因此，需從臨床癥狀及體征指標、血液、生化指標、病理學(xué)指標等多方面對實驗動物模型進行評價，同時需對實驗動物年齡、性別、品系、基因型等，以及飼養(yǎng)環(huán)境、飲食、健康狀況、微生物學(xué)等環(huán)境因素做出明確要求，以作為規(guī)范化模型的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[15]。其中，出現(xiàn)明顯的特征性病理學(xué)變化是重要的評價指標之一。病理學(xué)技術(shù)能夠提供準確、客觀且全面的評價，對實驗動物模型的開發(fā)、相關(guān)實驗設(shè)計、藥效及藥物安全性評價至關(guān)重要。

3 病理學(xué)評價在人類疾病實驗動物模型中的作用及意義

實驗動物模型是生物醫(yī)學(xué)研究中極其重要的“工具”與“載體”。在多種人類疾病模型的研究中，實驗動物模型能夠闡明人類疾病的發(fā)病機制以及用于藥物篩選、疫苗研發(fā)等，加深人類對疾病的理解，促進新療法和新診斷技術(shù)的發(fā)展，最終保護人類和動物的健康。因此，對每一種模型的優(yōu)勢和局限性進行深入的探究和描述，以最大限度地發(fā)揮其優(yōu)勢[15]。病理學(xué)分析能夠提供形態(tài)、分子、生化等數(shù)據(jù)，對于動物模型研究是必不可少的[16]。同時，還能夠?qū)⑿螒B(tài)學(xué)與發(fā)病機制聯(lián)系起來，有助于對疾病的理解。組織病理學(xué)是動物研究，尤其是疾病動物模型研究的“轉(zhuǎn)化終點金標準”[13]。

3.1 協(xié)助動物造模設(shè)計

動物模型是將潛在療法用于人體臨床試驗時輔助決策的重要工具。近來，也有不少報道顯示，臨床前動物實驗與隨后的人類臨床試驗結(jié)果的一致性較差。臨床前動物研究的評估非常重要，科研人員必須重視此類研究的計劃、實施、分析和報告的嚴謹性和質(zhì)量。在此研究過程中，病理學(xué)是提高數(shù)據(jù)質(zhì)量和實驗可重復(fù)性的重要方式。在造模條件的優(yōu)化、研究過程的實施、組織取材的計劃、實驗數(shù)據(jù)的分析等，病理學(xué)在其中發(fā)揮極其重要的作用[13]。因此，建議病理師應(yīng)盡早的參與到動物模型構(gòu)建的研究中，不僅能夠顯著提高造模的成功率，更能有效保障實驗?zāi)Ｐ偷目芍貜?fù)性與科學(xué)性。

3.2 評價動物模型特征性病變

目前，造模技術(shù)日新月異，包括基因編輯、生物誘導(dǎo)、物理干預(yù)、化學(xué)誘發(fā)等在內(nèi)的多種技術(shù)和方法不斷發(fā)展及創(chuàng)新，但每種技術(shù)的使用，都可能對實驗動物產(chǎn)生不同程度的病理學(xué)改變。不同的造模方法、造模劑量、造模時間等均可能導(dǎo)致組織器官出現(xiàn)不同的病理表現(xiàn)，不同的實驗動物品系、年齡、性別等也會影響動物的造模設(shè)計。只有通過病理學(xué)技術(shù)，才能明確造模引起的組織病變的位置、類型、特點及程度，才能夠快速、有效的構(gòu)建出理想的實驗動物模型用于后續(xù)研究[17]。此外，病理學(xué)技術(shù)在多種類基因編輯小鼠模型新表型的篩選與確證中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18]。通過病理學(xué)評價，能夠最大化從單個動物獲得的數(shù)據(jù)，減少完全評估某種模型或表型所需的動物數(shù)量，改進實驗以將對動物的影響降至最低，符合動物福利3R原則[19-20]。

病理學(xué)參與到實驗動物模型構(gòu)建，可以進行如下特征性病變的評價：①能夠明確病變發(fā)生的位置。例如，通過組織病理學(xué)可以觀察到飼喂高果糖的NAFLD模型和飼喂10%豬油的NAFLD模型肝細胞脂肪變性發(fā)生位置不同，前者主要發(fā)生在匯管區(qū)周圍，后者病變則集中于中央靜脈周圍[21]；②能夠判斷病變發(fā)生類型。例如，在進行腫瘤評估時，利用病理學(xué)技術(shù)能夠觀察到腫瘤發(fā)生的具體位置、細胞類型、細胞排列方式、浸潤程度等，進而確定腫瘤的類型及分期；③能夠輔助確定疾病的發(fā)病階段，且能夠直觀地顯示組織及細胞病變的損傷程度，并進一步對病變損傷程度進行分級。在腫瘤和癌變動物模型的評估中，可以通過組織學(xué)和細胞學(xué)分級方案來評估各種器官系統(tǒng)模型的生物學(xué)潛力。例如，上皮癌變的基因編輯小鼠往往表現(xiàn)出從癌前病變到惡變的多階段進展。這種多階段的進展在胰腺、前列腺、乳腺、雌性生殖系統(tǒng)管狀器官、腎臟、胃腸道、肺、肝臟和皮膚中都可以觀察到。對病變損傷進行分級，有利于后續(xù)利用數(shù)字評分系統(tǒng)對特定疾病的治療效果和結(jié)果進行衡量[16]；④病理特殊染色技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)及免疫熒光技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用在病變的定位、定性及定量分析中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是評價動物模型是否發(fā)生特征性病變的重要手段。

3.3 發(fā)現(xiàn)造模可能伴發(fā)的病變

實驗動物模型只能在一定程度上還原疾病相關(guān)的一些特征，并不能完全模擬人類的疾病。因此，在造模過程中勢必會出現(xiàn)一些非特征性病變或由于人為因素所造成的背景病變。通過病理學(xué)技術(shù)，能夠發(fā)現(xiàn)與理想模型無關(guān)的非特異性病變及背景病變，并盡可能排除其對實驗?zāi)Ｐ蜆?gòu)建及應(yīng)用造成的干擾。

3.4 分析病理變化與疾病機理的相關(guān)性

每一種疾病模型的構(gòu)建會涉及多種造模方法，在通過這些方法初步構(gòu)建出疾病相關(guān)動物模型后，通過病理學(xué)技術(shù)，能夠進一步分析模型與所研究疾病的相關(guān)程度，以篩選出最適宜的動物模型。此外，病理學(xué)評價還有助于解釋研究中其他生物學(xué)發(fā)現(xiàn)，并結(jié)合研究目的、實驗背景等進行綜合分析與驗證[22-23]。近幾年來，多種新發(fā)傳染病的流行，危害著人類健康，特別是2019年爆發(fā)的COVID-19，對人類生命健康造成重大威脅，對該疾病防控和治療，迫切需要篩選或制備對COVID-19易感的實驗動物模型用于機制研究、藥物治療及疫苗篩選。Cleary等[24]報道，已成功制備了可以感染COVID-19的模型，如基因編輯的hACE2小鼠、金黃地鼠、水貂等，該類模型出現(xiàn)與人相似的呼吸窘迫臨床表現(xiàn)，應(yīng)用病理學(xué)技術(shù)也能夠觀察到與臨床癥狀相呼應(yīng)的較典型的間質(zhì)性肺炎及伴發(fā)的病變。

總之，動物病理學(xué)作為疾病診斷的“終結(jié)者”，可以從病理學(xué)變化，明確評價實驗動物造模是否成功，也可充分體現(xiàn)動物模型與造模條件的相關(guān)性、疾病模型的階段性、藥物或疫苗的有效性、安全性等，在使用實驗動物模型的相關(guān)研究中發(fā)揮著不可替代的作用。在進行病理學(xué)評價的過程中，發(fā)現(xiàn)包括造模方法設(shè)計缺陷、實驗動物選取或飼養(yǎng)不當(dāng)、實驗分組設(shè)計不合理、取材不規(guī)范等一系列問題，要想獲得較為準確的病理學(xué)評價結(jié)果，必須要提供實驗動物品系、年齡、性別、基因型、飼養(yǎng)管理條件等基礎(chǔ)信息，還應(yīng)提供造模所用方法以及實驗動物分組情況，以確保病理學(xué)家能夠具體情況具體分析，得出更為精準的病理學(xué)評價結(jié)果。

4 病理學(xué)在人類疾病實驗動物模型應(yīng)用中的展望

人類疾病動物模型的成功構(gòu)建，使得人類疾病致病因素解析、發(fā)病機制探討、藥物新靶點發(fā)現(xiàn)、臨床前藥物篩選、藥效評價等研究能夠準確順利進行，是生物醫(yī)學(xué)研究和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展不可或缺的支撐條件[1]。實驗動物模型作為我國科學(xué)研究、生物醫(yī)藥和健康產(chǎn)品研發(fā)不可替代的核心生物資源，其成功構(gòu)建在提高我國自主創(chuàng)新能力、維系國家安全、發(fā)展醫(yī)藥衛(wèi)生健康產(chǎn)業(yè)等方面具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的市場前景。

一直以來，組織病理學(xué)評價作為制藥業(yè)安全性研究中有價值的“終點”，只有經(jīng)過組織病理學(xué)評價，新藥才有機會進入人體臨床試驗階段[19]。由于標準化病理學(xué)評價方案的缺乏、實驗病理學(xué)及比較病理學(xué)人才的缺失以及病理學(xué)評價全過程的成本問題，病理學(xué)評價并未在制藥行業(yè)以外的動物研究中普及。實驗動物相關(guān)從業(yè)人員已經(jīng)逐步認識到病理學(xué)的重要性，因為病理學(xué)評價標準能夠規(guī)范實驗動物模型的構(gòu)建與使用，提高實驗動物模型的相似性、可重復(fù)性、可靠性、適用性及可控性。有經(jīng)驗的病理學(xué)家除了擁有豐富的病理生物學(xué)相關(guān)知識，能夠?qū)嶒瀯游镞M行準確的形態(tài)學(xué)觀察與診斷外，還可以提供動物模型構(gòu)建、實驗設(shè)計、最佳模型樣本收集和處理、數(shù)據(jù)解釋和報告等方面的專業(yè)知識[16, 25]。為了拓寬病理學(xué)評價的應(yīng)用范圍，推動病理學(xué)評價體系的構(gòu)建，需要進一步加強實驗病理學(xué)及比較病理學(xué)人才的培養(yǎng)，加快標準化的病理學(xué)評價方案的制定，加速實驗動物病理學(xué)及比較病理學(xué)相關(guān)圖譜的編撰修訂，同時輔以對病理人才培養(yǎng)、病理相關(guān)政策制定及病理技術(shù)革新的資金支持，以期將病理學(xué)評價全方位、多層次和寬領(lǐng)域的應(yīng)用于未來的生物醫(yī)學(xué)研究中。