泛發性雀斑樣痣三例SASH1基因突變研究

張天驕，楊秀敏，魏愛華

泛發性雀斑樣痣（generalized lentiginosis，GL）是一種罕見的色素障礙性皮膚病，多呈常染色體顯性遺傳。臨床表現為嬰幼兒時期即出現的大量棕褐至黑褐色色素沉著斑，以日光暴露區域為著，可累及口腔黏膜、外陰黏膜和掌跖等部位，部分患者可并發心血管疾病、神經性耳聾、智力低下、性腺發育不全、骨骼發育異常、身材矮小等系統性疾病。目前已報道PTPN1、BRAF、RAF1及SASH1基因的變異與GL的發病相關[1]。本研究收集了3例臨床診斷為GL的患者，為明確診斷并提供遺傳咨詢，通過全外顯子測序的方法，對該3例患者進行了基因檢測和遺傳學分析。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

先證者1，男，9歲。全身皮膚色素沉著斑8年余。患兒出生3個月后，面頸部出現粟粒至黃豆粒大小的褐色斑疹，無痛癢等自覺癥狀，漸延及軀干、四肢。患兒智力正常，生長發育良好，系統查體及多種輔助檢查均未見異常。否認家族類似疾病史及近親婚育史。皮膚科查體：面頸部、軀干及四肢散在粟粒至蠶豆粒大小的棕褐色斑疹，以曝光部位為著，掌跖及口腔黏膜未見累及（圖1a）。

先證者2，男，8歲。全身皮膚色素沉著斑7年余。患兒出生6個月后，面部出現粟粒至綠豆粒大小的褐色斑疹，顏色深淺不一，漸延及軀干、四肢。近1年，面部皮損部分消退。患兒智力正常，生長發育良好，系統查體及輔助檢查均未見異常。否認家族史及家族近親婚育史。皮膚科查體：面頸部、軀干及四肢彌散粟粒至綠豆粒大小的淺褐色至黑褐色斑疹，以曝光部位為著，掌跖及口腔黏膜未見累及（圖1b）。

先證者3，女，6歲。全身皮膚色素沉著斑5年余。患兒出生6個月后，面部及雙上肢曝光部位出現粟粒至黃豆粒大小的棕褐色斑疹，圓形或橢圓形，漸延及頸部、軀干及雙下肢。患兒智力正常，生長發育良好，系統查體及輔助檢查均未見異常。否認家族類似疾病史及近親婚育史。皮膚科查體：面部、四肢彌漫粟粒至黃豆大小棕褐色斑疹，部分融合成片；軀干部亦可見散在分布的少量類似皮損（圖1c）。

圖1 泛發性雀斑樣痣患兒臨床皮損表現

3位先證者的監護人均拒絕皮膚組織病理檢查，故無相關組織病理檢查資料。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取 由監護人簽署知情同意后，分別采集3例先證者及其父母外周血各2 ml，采用磁珠法通用型DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取外周血基因組DNA。

1.2.2 全外顯子組測序 先證者DNA樣品通過Covaris破碎儀隨機打斷成長度為180-～80 bp的片段并制備文庫，利用Agilent SureSelect Human All Exon V6試劑盒對目標區域進行捕獲，Illumina高通量測序平臺對變異進行檢測。

1.2.3 Sanger測序 Sanger測序驗證高通量測序結果，并對其父母行家系內驗證，確定變異的親本來源。

1.2.4 生物信息學分析 對測序數據進行生物信息學分析，以GRCh37/UCSC hg19作為參考基因組進行比對，依據嚴格的篩選標準對變異進行過濾，并添加人類基因組突變頻率數據庫（Genome Aggregation Database, gnomAD）東亞人群、千人基因組數據庫（1000 Genomes Project）、RefSeq參考序列數據庫、人類基因突變數據庫（the Human Gene Database,HGMD）、在線人類孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）以及蛋白功能預測軟件等相關注釋信息。對于未見文獻報道及數據庫收錄的新變異，根據美國醫學遺傳學與基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）發布的《序列變異解讀的標準和指南》，對變異進行致病性分級。

2 結果

在3例先證者SASH1基因上檢出3種雜合變異，根據ACMG指南，分級為致病性變異和可能致病性變異，未發現PTPN11，RAF，BRAF，PTEN，LKB1等文獻報道的其他可伴有雀斑樣痣表現的基因變異。結合臨床表型和分子診斷，3例先證者均確診為泛發性雀斑樣痣。

先證者1. 檢出SASH1基因c.1526_1527insAAGT（p.Leu511Lysfs*21）雜合移碼變異，先證者父母（通過親子鑒定）均未攜帶，考慮為de novo變異（不排除生殖系嵌合等可能）。此變異在gnomAD東亞人群及1000 Genomes中國人群中均未收錄，在HGMD數據庫中為已報道的致病性突變。根據ACMG指南，該變異分級為致病（PS2+PS4）（表1，圖2）。

先證者2. 檢出SASH1基因c.1520C＞T（p.Ser507Phe）雜合錯義變異，先證者父母（通過親子鑒定）均無攜帶，考慮de novo變異（不排除生殖系嵌合等可能）。該變異尚無文獻報道，在gnomAD東亞人群、1000 Genomes中國人群及HGMD中國人群中均無收錄，生物信息分析軟件SIFT、Mutation_Taster和PolyPhen2均預測有害。根據ACMG指南，c.1520C＞T（p.Ser507Phe）分級為可能致病（PS2+PM2+PP2+PP3+PP4）（表1，圖2）。

表1 3例先證者基因檢測結果

圖2 3例先證者家系圖及家系SASH1基因Sanger測序驗證結果

先證者3. 檢出SASH1基因c.1761C＞G（p.Ser587Arg）雜合錯義變異，母親未攜帶（父親已故）。該變異已有文獻報道[2,3]，但gnomAD東亞人群、1000 Genomes中國人群和HGMD中國人群中目前均無收錄。該變異在SASH1基因高度保守的SH3功能域上，Clinvar收錄該區域的錯義突變為致病變異。已有功能研究證實，該變異可引起SASH1蛋白表達量顯著降低[3]。生物信息分析軟件SIFT、Mutation_Taster和PolyPhen2均預測有害。根據ACMG指南，該變異分級為致病（PS3+PM1+PM2+PP2+PP3+PP4）（表1，圖2）。

3 討論

GL是一種以幼年時期迅速出現的大量黑褐色斑疹為主要特征的色素障礙性皮膚病[4,5]。根據有無系統受累，分為發疹性黑子病（eruptive lentiginosis）和泛發性黑子綜合征（multiple lentigines syndrome）。前者表現為僅累及皮膚的損害，后者除典型的皮膚表現外，可并發眼距增寬、內眥贅皮、上瞼下垂等特殊面容及心血管、呼吸、神經、骨骼，泌尿生殖等全身系統的異常。

據文獻報道，超過90%的泛發性黑子綜合征的發生與PTPN11、BRAF及RAF1基因突變相關[6]，而發疹性黑子病基因研究相對較少。2015年，Shellman等[7]將發疹性黑子病的致病基因定位于SASH1基因。SASH1基因定位于染色體6q24.3區域，共包含22個外顯子，其編碼蛋白是由l 247個氨基酸組成的SLY家族的信號銜接蛋白，包含1個高度保守的功能域，1個SH3功能域和2個SAM功能域。研究證實，該基因的突變與人類的異常皮膚色素沉著有關。Shellman等[7]發現，突變的SASH1蛋白通過增加與Gαs亞基和IQ功能域GTP酶激活蛋白1（IQGAP1）的結合導致E鈣黏素表達減少，引起GL發病過程中黑素細胞特定的遷移和分布。在一項最新的研究中，Cui等[3]發現SASH1突變可通過抑制SASH1-TGF-β1信號途徑，導致表皮中黑素細胞的形態和定位異常，從而引起異常的色素沉著。

迄今，僅在4例診斷為發疹性黑子病的患者中檢測到了SASH1變異[4,7,8]，而在泛發性黑子綜合征型的患者中尚未發現該基因上的變異。值得注意的是，SASH1基因變異導致的色素異常表型具有異質性，可與其他臨床綜合征發生重疊。基因突變位點不同，表型可不同。例如，SASH1基因變異也可致遺傳性泛發性色素異常癥（dyschromatosis universalis hereditarian，DUH）。DUH是一種常染色體顯性遺傳病，常表現為不同程度的色素沉著與色素減退斑相互間雜，呈現斑駁樣外觀，皮損常均勻泛發全身而與日光暴露無關。皮損的形態和顏色不隨年齡增長和季節變化而改變。本研究中的3例先證者均表現為以曝光部位為主的雀斑樣斑疹，全身未見類似DUH的色素減退斑。先證者2面部皮損隨著年齡增長有部分消退。對比既往報道的DUH患者的表型，結合基因檢測結果，本研究3例先證者均診斷為泛發性雀斑樣痣。3例先證者均未發現皮膚以外的系統病變，推測原因可能為：①均屬于發疹性黑子病；②GL的皮損常發生在幼年，系統性病變多發生于成年以后或者更晚，3例患兒均還未到系統性損害的發病年齡。目前尚無確切方法早期區分發疹性黑子和泛發性黑子綜合征。GL的早期確診，有利于檢測可能出現的系統病變并及時干預。筆者將對這3例患兒進行長期的隨訪觀察。

目前文獻共報道了11種SASH1基因變異與色素異常性皮膚病的發生相關。其中，SASH1基因p.S507A,p.S513R,p.S519N和c.1527_1530dupAAGT變異與GL表型相關[4,7,8]，涉及4例患者。這些患者均表現為以曝光部位為主的散在或密集分布的黑褐色斑疹，僅有1例患者伴有少量散在的色素減退斑[4]。SASH1基因p.S587R，p.E509K，p.L515P，p.Y551H，p.Y551D和p.M595T變異與DUH的發生相關[2,9,10]，患者均表現為全身泛發的不規則色素沉著斑，夾雜均勻分布的色素減退斑，呈網狀或斑駁樣外觀。SASH1基因純合變異p.E617K可導致以色素異常、掌跖角化、復發性鱗狀細胞癌和斑禿為表現的臨床綜合征[11]。

本研究中，先證者1檢出的SASH1基因c.1526_1527dupAAGT變異，曾在1例臨床診斷為GL的中國患者中檢出。該患者與本研究中的3例患者具有相似的臨床表型[4]。先證者2檢出的SASH1基因p.S507F變異，目前尚無文獻報道與數據庫收錄，但在相同氨基酸位置的p.S507A變異曾在1例表現為GL的中國患者中檢出[8]。先證者3檢出的SASH1基因p.S587R變異已有文獻報道，在兩個不同研究中的中國DUH家系中，患者均檢出了此變異[2,3]。本研究為首次報道該變異可致GL表型，進一步證實了SASH1基因變異所致的臨床表型具有異質性。

本研究通過全外顯子組測序結合生物信息學分析的方法，確診了3例GL散發病例，鑒定出SASH1基因的3種變異，進一步證實了SASH1是導致雀斑樣痣表型伴或不伴色素異常癥的致病基因[4,5]。新變異的鑒定，豐富了人類基因突變數據庫，為泛發性雀斑樣痣的遺傳咨詢提供了有益信息。