貉感染停乳鏈球菌的實驗分析

蓋玉強，張鵬程，韓先杰

青島農業大學動物醫學院，山東青島 266109

停乳鏈球菌是鏈球菌屬的一員，是牛、山羊和綿羊急性、慢性乳腺炎的病原菌之一[1]，分停乳鏈球菌停乳亞種和停乳鏈球菌類馬亞種兩個亞種[2]。該菌能通過皮膚傷口、臍帶和扁桃體等進入血液，隨后導致菌血癥或敗血癥[3]。2020年8月初，某養貉場部分100日齡左右的幼貉發病，表現食欲不振、精神萎靡、消瘦、咳嗽，個別幼貉還表現腹瀉、運動失調等臨床癥狀，數日之后死亡，發病率約為6%。剖檢發現主要病變為肺臟腫大、表面有出血點，肝、脾腫大、淤血，內臟淋巴結腫大、出血。為了探明幼貉的發病原因，本文從病死貉的肺臟、脾臟中分離出一株細菌，經細菌革蘭氏染色及細菌16S rDNA基因鑒定，最后確認該分離菌為停乳鏈球菌類馬亞種。該菌對小鼠有致病性，對阿莫西林等藥物敏感，用敏感藥物治療控制病情。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

某養貉場發病死亡仔幼貉的肺、脾臟。

1.1.2 主要試劑

革蘭氏染液試劑盒、綿羊血平板、腦心浸液培養基、TSA培養基、葡糖糖、蔗糖等生化反應管等購自青島海博生物技術有限公司；DL2000 DNA Marker、Premix Taq等購自寶生物工程（大連）有限公司；核酸染料、瓊脂糖購自生工生物工程（上海）股份有限公司。藥敏紙片由齊魯動物保健品有限公司提供，昆明系小白鼠購自青島大任富城畜牧有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養

對病死貉的體表消毒后進行解剖，無菌取肺臟、脾臟，在綿羊血平板上進行三區劃線、37 ℃培養24～48 h。挑取單菌落進行革蘭氏染色，觀察菌落形態。另挑取單個菌落接種到已滅菌的腦心浸液肉湯中培養36 h。

1.2.2 生化鑒定

對分離菌分別進行CAMP試驗、VP試驗、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、水楊苷、七葉苷等代謝試驗。

1.2.3 16S rDNA鑒定

根據多種革蘭氏陽性菌16S rDNA基因序列，設計、合成一對擴增革蘭氏陽性菌16S rDNA的通用引物：上游5′-CCTGCTGTTAGAGAAGAATGA-3′，下游5′-AACACCTGTCACTCCTGCC-3′，引物由北京睿博興科生物技術有限公司進行合成。采用煮沸法提取細菌DNA作為模板，進行16S rDNA基因擴增，反應體系（25 μL）為：Premix Taq 12.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板1.5 μL、無菌去離子水9 μL。PCR擴增程序為：預變性94℃、4min；變性94 ℃、30 s；退火53.6 ℃、30 s，72 ℃延伸30 s，擴增30個循環；終延伸72 ℃、7 min，4 ℃終止反應。

PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外投射儀觀察結果。

1.2.4 PCR產物測序

將PCR產物送至青島天澤生物技術有限公司進行基因測序，將所得序列用NCBI的Blast工具進行基因序列的同源性對比。

1.2.5 致病性試驗

取小白鼠6只，設試驗組和對照組，每組3只。試驗組每組腹腔注射含菌腦心浸液0.2 mL，對照組注射等量滅菌腦心浸液。接種后觀察小鼠的臨診癥狀、病理變化，并進行細菌分離。

1.2.6 藥敏試驗

用紙片擴散法進行藥敏試驗。將100 μL含菌腦心浸液均勻的涂布于含5%馬血清的TSA平板，在培養基的表面貼上青霉素G等藥敏紙片，37 ℃培養36 h，隨后測量抑菌圈的直徑，按照標準判定藥物的敏感性[4]。

2 結果

2.1 細菌的培養與形態特征

分離菌在綿羊鮮血平板上培養24 h后似針尖大小，培養48 h后可見呈圓形、直徑約0.6～1.0 mm、灰白色、半透明、表面光滑、邊緣整齊的菌落，呈β型溶血。經革蘭氏染色，細菌為G+球菌，呈圓形或卵圓形，少數單個或者成對存在，多成短鏈狀排列。

2.2 分離菌生化試驗

分離菌CAMP試驗陰性、VP試驗陰性，發酵葡萄糖和蔗糖，能利用水楊苷，不利用乳糖、菊糖、甘露醇、山梨醇和七葉苷（見表1）。

表1 細菌的生化試驗結果

2.3 16S rDNA基因擴增與序列分析

分離菌的16S rDNA的PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外透射儀觀察，擴增的特異性條帶大小約為746 bp，與預期擴增大小相符。經Blast同源性比較，分離菌的16S rDNA序列與停乳鏈球菌似馬亞種（序列號MN880121）同源性達到99.72%。

2.4 動物致病性試驗

實驗組接種含菌肉湯12 h后，小鼠表現精神萎靡、不愿活動、身體蜷縮、呼吸急促，3只攻毒小鼠在48 h內死亡。死亡小鼠解剖病變主要表現肝、脾和腎腫脹、淤血，肺腫脹、充血。對照組小鼠一直健康存活。取死亡小鼠的病變組織接種綿羊鮮血平板，分離的細菌菌落形態和菌體染色特征與2.1的結果一致。

2.5 藥敏試驗

經測量所用藥敏紙片對分離菌的抑菌圈直徑，依據藥物的敏感性判定標準，該菌對阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻呋和恩諾沙星敏感，對氟苯尼考、卡那霉素為中敏，對林可霉素、強力霉素、多粘菌素B耐藥。選用阿莫西林進行治療。

3 討論

本文從發病仔貉的肺臟、脾臟分離一株細菌，經細菌革蘭氏染色、細菌16S rDNA基因測序和同源性比較，確定病原為停乳鏈球菌似馬亞種。為了進一步探明仔貉感染停乳鏈球菌的原因，經過深入調查得知，發病的幼貉均為出生較晚的一批，這些幼貉出生后表現發育不良，養殖場為了增加幼貉的營養，在飼喂日常配制飼料以外，還為其提供羊奶，羊奶來自同村一個山羊養殖戶。通過實驗室進一步對該山羊所產羊奶的微生物檢測，檢測出的停乳鏈球菌與發病幼貉體內的一致。

立即對患病幼貉進行隔離治療，每只幼貉按15 mg/kg注射阿莫西林，每天1次，連用3 d。同時用0.5%的過氧乙酸對籠具及籠下的糞便、毛屑等消毒。對幼貉停喂生羊奶，將生羊奶煮沸10 min待冷卻后再飼喂。采取上述措施后1周左右病情被控制，再無新的病例發生。