不同日齡豬胰島形態學特點及分離純化的比較研究

張光磊，梁云坤，金麗蘭

吉林省敦化市農業農村局畜牧站，吉林敦化 133700

胰島移植被認為是治療Ⅰ型糖尿病的最理想的方法。豬胰島細胞和人胰島細胞的氨基酸序列僅相差一個，能夠在人體內發揮調節血糖水平的正常功能。所以，豬胰島已經成為治療人Ⅰ型糖尿病的最理想供體。關于豬胰島分離純化方面已經積累了大量研究資料。結果表明，豬胰腺結締組織發達，內分泌與外分泌連接緊密；胰島周圍缺乏被摸保護，容易破碎。此外，豬的年齡、品系和體外缺血時間等同樣是影響胰島產量和活力的客觀因素。此外，朱海濤等認為豬胰島細胞一般來源于胎豬、新生豬或成年豬，但是何時期的豬胰島細胞更適合于人類進行異種移植，現仍存在爭議。因此，本試驗為進一步探討完善并建立豬胰島細胞分離純化方法提供參考數據，以出生1日齡、50日齡、100日齡、150日齡豬為試驗動物，采用膠原酶注射法、DTZ染色法、histopaque法等進行豬胰島形態學觀察及胰島分離純化，并采用葡萄糖刺激胰島素釋放試驗檢測1日齡和150日齡豬胰島體外功能。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗選用出生1日齡、50日齡、100日齡及150日齡健康長白豬的胰腺組織各5例。

1.2 試劑與儀器

試劑：膠原酶Ⅴ、DTZ（雙硫腙）、Histopaque-1077、Hanks、臺盼藍均購自于Sigma公司；胎牛血清、RPMI-1640購于Gibco公司；ELISA檢測試劑盒購于RD公司。主要儀器設備：實體顯微鏡（OLYMPUS）、臥式圓形壓力蒸汽滅菌器（TOMY KOGYO）、二氧化碳培養箱（Sanyo MCO-18AIC）、電熱恒溫鼓風干燥箱、電子天平，離心機，超級潔凈工作臺等。

1.3 方法

1.3.1 豬胰腺的取材

1日齡、50日齡豬的胰腺于實驗室采用外科手術方法獲得，而100日齡、150日齡豬的胰腺取自龍井市屠宰場。取材時，保證熱缺血小于10 min和冷缺血時間小于30 min。取材后，立即剝離胰腺組織，用含雙抗Hanks液清洗，并放入RPMI-1640緩沖液置于保溫箱中。剝離胰腺時注意無菌環境低溫條件操作，同時運用含雙抗生理鹽水或4 ℃的冷Hanks液清洗。

1.3.2 胰島細胞消化

找到胰腺組織的胰管注射膠原酶消化液結扎后，放入37 ℃水浴鍋中靜置消化，震蕩數次，組織變為細沙狀后加入終止液，翻轉，濾網過濾，收集分離物，DTZ染色，觀察分離物形態學特征。

1.3.3 胰島細胞分離純化

胰島純化分離物懸液轉入離心管，離心棄上清液，加入終止液洗滌翻轉，反復操作兩次。將Histopaque-1077與沉淀物混勻，再緩慢傾斜加入等量DMEM培養液，使兩種液體出現分層，進行離心，離心后，離心管中液體分層明顯，兩層間存在懸浮物為豬胰島細胞聚集團，吸取離心管中的全部胰島，加入培養液混勻，離心棄上清，反復操作兩次。收集胰島細胞，并且體外培養同時進行胰島體外胰島素釋放功能測定。

1.3.4 胰島計數和提純

運用特異性DTZ染色法，胰島染成猩紅色，非胰島細胞不著色，染色后對胰島在顯微鏡下觀察計數，統計出胰島個數、純度和胰島直徑大小。

1.3.5 體外培養胰島素釋放測定

對分離純化后的胰島進行臺盼藍染色，染色后統計胰島細胞存活率，被染成藍色細胞為死細胞，不著色為活細胞。

1.3.6 胰島體外功能測定

挑選純化后的胰島細胞，并適應體外培養基，同時分組培養，在48孔培養板中加入RPMI-1640培養液，隨后將分好組的胰島細胞放入，收集上清液并用ELISA試劑盒進行胰島素含量測定。

1.3.7 統計學方法

通過SPSS統計軟件分析數據，數據差異顯著性進行單因素ANOVA、t檢驗，p＜0.05為有意義。

2 結果

2.1 不同日齡豬胰島的形態學特點

高清顯微鏡下可見胰島細胞呈不規則圓形或者橢圓形，大小不一，表面較為光滑，多數胰島細胞包膜完整，存在極少數破裂細胞碎片。分離后胰島DTZ染色，每年齡段隨機抽取20個胰島測量其直徑。結果見表1。

表1 不同日齡豬胰島DTZ染色直徑比較

2.2 不同日齡的豬胰島細胞獲得量、分離純度和存活率

在熱缺血時間少于10 min，冷缺血時間少于30 min，膠原酶配置濃度1.0 mg/mL或1.5 mg/mL，消化時間15 min為基準，取相同部位胰腺分離純化，不同日齡組豬胰島獲得量、胰島細胞數量和分離純度上均有顯著差異（p＜0.05），不同組間數據也具有顯著性（p＜0.05）。

表2 不同日齡豬胰島團收獲量、純度及存活率

2.3 1日齡和150日齡豬胰島葡萄糖刺激胰島素釋放檢測結果

表3 豬胰島素釋放量

由表3可知，兩組間比較，差異顯著(p＜0.05)。

3 討論

目前有很多研究者研究豬胰島細胞的分離純化，在小鼠和大鼠中也應用膽總管穿刺法等一系列方法。每種方法存在各種不同客觀影響因素，從而在胰島分離數量上有顯著差異。在豬胰島分離中，胰管注射法只有少量學者采用，原因在于豬胰管位置難以確定并且胰管開口細小難以分辨，所消耗藥品尤其是膠原蛋白酶量非常大，成本高效率低。由于1日齡豬胰腺腺體發育未完全，直接可以采用腺體注射，結扎并消化，這種辦法解決了對消化效果的影響并節省藥品。在純化方法上，現普遍應用的是Ficoll密度梯度離心法，國內只在大鼠和小鼠的胰島消化中使用Histopaque-1077純化方法，但在豬胰島純化中未見發表。該法對比Ficoll密度梯度離心法結果，操作過程相對簡易，但提純略低，Histopaque-1077純化方法對豬胰島純化效果有待于進一步的探討。

對于消化時間和膠原酶濃度的研究，多數學者認為完全消化程度體現在出現白色小顆粒物質并呈現泥沙狀。在前期工作中，探討了膠原酶濃度、消化時間及對不同日齡豬胰島分離純化的影響，結果表明，出生1日齡和50日齡豬最佳膠原酶濃度為1 mg/mL、消化時間為15 min，能獲得較為完整的胰島細胞，消化時間在30～45 min之間時，雖然胰腺組織可以消化成泥沙狀，經DTZ染色鏡下觀察看到胰島聚集組織出現過多碎片，100日齡與150日齡組中最佳膠原酶濃度為1.5 mg/mL、消化時間確定為15 min，這樣可以得到較多的胰島細胞，膠原酶濃度為2 mg/mL時容易使胰島出現破裂現象。因此，本試驗中1日齡和50日齡的豬胰腺消化試驗中，采用膠原酶濃度為1 mg/mL、消化時間為15 min，而100日齡及以上日齡豬采用的成年豬膠原酶濃度為1.5 mg/mL、消化時間為15 min，該結果與Jin SM 等學者發表過的膠原酶1.0 mg/mL、1.8 mg/mL濃度比較，消化時間長短，胰島數量上存在不顯著差異。

因此可以確定豬日齡增長的同時，體內胰島數量亦在增加。不同的胰島細胞分泌不同的激素，因此胰島細胞在胚胎后發育中處于正常分化狀態，同時豬胰島B細胞同時分泌兩種不同的激素，說明豬胰島細胞有一定的分化增生能力。

參考文獻：略