神經干細胞與脊髓脫細胞支架體外共培養的可行性

漆國棟，江瓊，伍亞民，申開琴，楊琴，漆偉

1.重慶市中醫骨科醫院骨科，重慶市 400010；2.重慶醫科大學中醫藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶市 400016；3.陸軍軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所，創傷燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶市400042

脊髓損傷致殘率高，嚴重影響患者生活質量。目前臨床康復采用多學科協同方案，但效果有限[1]。種子細胞與生物支架構建的脊髓組織工程可能成為未來脊髓損傷康復的關鍵方向，現階段重點為選擇不同種類細胞與支架，探索最適宜的構建方案[2-3]。神經干細胞(neural stem cells,NSCs)源于神經組織，作為種子細胞中最能定向分化為神經譜系的細胞，可直接代替損傷的神經樣細胞，分泌多種神經營養因子，改善損傷處微環境，但存在單獨應用時存活率較低、分化不可控等缺點[4-6]。脊髓脫細胞支架(spinal cord acellular scaffold,SCAS)為正常脊髓組織經脫除細胞后保留的細胞外基質，成分和結構與正常脊髓高度相似，具有低免疫原性和良好的生物相容性[7]。將骨髓間充質干細胞種植于SCAS，發現該細胞與支架復合良好，可生存、生長并分化為神經譜系細胞[8-9]。本課題組前期對體外培養的NSCs增殖與分化調控進行探索[10-12]，結合相關文獻發現NSCs 具備復合生物支架構建脊髓組織工程的可行性[13]。本研究選擇NSCs 作為種子細胞，與SCAS 進行脊髓組織工程構建，初步探討該模式的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑與儀器

SPF 級 新 生24 h Sprague-Dawley 大 鼠、SPF 級Sprague-Dawley 雌性大鼠，購自重慶醫科大學動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK(渝)2012-0001。所有操作均依據《醫學實驗動物管理實施細則》要求，符合動物福利與倫理原則。

Neural basal 培養基、B-27、Acctuase 酶、胎牛血清：美國GIBCO 公司。堿性纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)：美國PEPROTECH 公司。小鼠單克隆抗Nestin 抗體：美國MILLIPORE 公司。兔多克隆抗膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體：美國INVITROGEN公司。小鼠單克隆抗微管相關蛋白-2 (microtubule associated protein-2,MAP-2)抗體：英國ABCAM 公司。DMEM/F12 培養基、0.25%胰酶：美國HYCLONE 公司；DyLight488標記山羊抗小鼠二抗、TRITC 標記山羊抗兔二抗、DAPI、HE 染色試劑盒、免疫組化染色試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。TritonX-100、脫氧膽酸鈉、PBS、正常山羊血清：北京索萊寶科技有限公司。激光共聚焦顯微鏡、冰凍切片機：德國LEICA 公司。熒光倒置顯微鏡：日本OLYMPUS 公司。冷凍干燥機、細胞培養箱、-80 ℃冰箱：美國THERMO FISHER SCIENTIFIC公司。掃描式電子顯微鏡：日本HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 NSCs

1.2.1.1 原代培養及傳代

新生24 h 內大鼠5 只，斷頭取腦。無菌條件下仔細剝離腦膜和血管，眼科鑷前緣解剖分離大腦皮質，鋒利剪刀剪成1 mm3小塊。加適量0.25%胰酶，37 ℃消化15～20 min；胎牛血清終止消化，藍槍頭均勻用力吹打10～15 次，200 目細胞篩過濾，形成單細胞懸液。離心，棄上清液，加適量培養基吹打、重懸。重復離心、重懸步驟。細胞計數，以1×106/ml 接種于6 cm培養皿中，增殖培養基含DMEM/F12、2%B-27、20 ng/ml EGF 和20 ng/ml bFGF，培養箱中培養。每2～3 d 半量換液1 次，6～7 d 傳代1 次。傳代時，細胞懸液離心，棄上清液，Acctuase 酶吹打、重懸，37 ℃消化10 min；離心，去Acctuase 酶，加培養基，均勻用力吹打30～50 次，加入適量增殖培養基重懸。傳代后培養方式同原代。

1.2.1.2 鑒定

1.2.1.2.1 Nestin鑒定

取第3 代神經球，接種于多聚賴氨酸包被的六孔板無菌爬片中培養4 h 貼壁。4%多聚甲醛固定，0.5%TritonX-100 破膜，10%山羊血清封閉。加Nestin 一抗(1∶200) 4 ℃孵育過夜。加Dylight488 標記山羊抗小鼠二抗(1∶100)37 ℃孵育1 h。DAPI 染核，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.1.2.2 分化鑒定

取第3 代神經球吹散后，接種于多聚賴氨酸包被后的六孔板無菌爬片中分化培養7 d，分化培養基含Neural basal、2%B-27和10%胎牛血清。4%多聚甲醛固定，0.5% TritonX-100 破膜，10%山羊血清封閉。加Map-2 (1∶500)、GFAP(1∶1000)一抗4 ℃孵育過夜。加Dylight488 標記山羊抗小鼠(1∶100)、TRITC標記山羊抗兔(1∶100)二抗37 ℃孵育1 h。DAPI染核，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.2 SCAS

1.2.2.1 制備

雌性Sprague-Dawley 大鼠20 只，1%苯妥英鈉45 mg/kg 腹腔注射麻醉，無菌條件下經心臟灌注無菌PBS。完全取出胸段脊柱，置0 ℃D-hanks 中。取部分完整脊髓(正常脊髓)，修剪為10 mm 左右小段，-20 ℃保存。

取部分脊髓(SCAS)，置-80 ℃冰箱1 h，-20 ℃、4 ℃、37 ℃梯度解凍，無菌蒸餾水浸泡6 h，每2 小時換水1 次。脊髓修剪為10 mm 左右小段，依次浸入2%TritonX-100 溶液，超聲振蕩5 min (振幅20%，振5 s 停5 s)，室溫持續振蕩3 h (170 r/min)；置0.01 mol/L PBS 持續振蕩3 h；置10%氯化鈉溶液持續振蕩15 min；置純水持續振蕩15 min；置10%氯化鈉溶液持續振蕩15 min；置純水持續振蕩15 min；置2%脫氧膽酸鈉溶液，超聲振蕩5 min (振幅20%，振5 s 停5 s)，室溫持續振蕩3 h (170 r/min) ；置0.01 mol/L PBS持續振蕩3 h。-20 ℃保存。

1.2.2.2 檢測

1.2.2.2.1 孔隙率

采用液體置換法。凍干脊髓各5 條置量筒中，加入V1 體積無水乙醇中，輕壓脊髓組織中空氣至無氣泡，此時體積為V2；將脊髓移出，此時體積為V3。

1.2.2.2.2 含水率

凍干脊髓各5 條稱重(W1)，置0.01 mol/L PBS 中浸泡2 h，吸出多余水分，稱重(W2)。

1.2.2.2.3 體外酶解率

凍干脊髓各5 條稱重(W1)，置含1 mg/ml 胰蛋白酶PBS中，37 ℃、100 r/min振蕩24 h取出，凍干后稱重(W2)。

1.2.2.2.4 組織學觀察

凍干脊髓4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片，HE染色，中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察。

1.2.3 體外共培養

取第3代神經球吹散，調節細胞濃度為5×106/ml，微量注射器取20μl接種于SCAS 中，培養箱孵育4 h，加分化培養基Neural basal、2% B-27 和10%胎牛血清，培養箱培養，每2～3 d換液1次。

1.2.3.1 免疫熒光染色

共培養1 d 后，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片，0.5% TritonX-100 破膜，10%山羊血清封閉。DAPI 染細胞核，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察細胞黏附情況。

1.2.3.2 免疫組化染色

共培養7 d 后，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片，過氧化氫滅活，5% BSA 封閉，加MAP-2 一抗(1∶100)4 ℃孵育過夜，加生物素標記二抗37 ℃0.5 h，SABC 37 ℃0.5 h，DAB 顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，光鏡下觀察細胞生長與分化情況。

1.2.3.3 掃描電鏡

共培養7 d 后，2%戊二醛固定，手術刀橫向切開，梯度酒精脫水，叔丁醇置換，粘臺，臨界點干燥，噴金，掃描電鏡下觀察細胞生長與分化情況。

1.3 統計學分析

采用SPSS 23.0 軟件統計分析相關數據。計量資料符合正態分布，以(±s)表示，采用獨立樣本t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 NSCs鑒定

原代細胞接種6～7 d 后，可見神經球增殖、融合變大，直徑可達到150～300 μm，呈球形、桑葚狀，透光性強(圖1A)。第3 代神經球95%以上細胞表達Nestin 蛋白(圖1B、圖1C)。分化培養7 d 后，可分化為神經樣細胞(圖1D)，表達MAP-2 蛋白(圖1E)和GFAP 蛋白(圖1F)，符合NSCs分化特點。

2.2 SCAS基本特征

正常大鼠脊髓呈圓柱狀，乳白色，稍有黏性(圖2A)。物理振蕩結合化學萃取過程中，萃取液變渾濁，脫細胞的脊髓略短縮，呈圓柱狀，乳白色，透光性增加，強度有所下降，黏性略有增加，硬脊膜保持完整(圖2B)。脫細胞脊髓的孔隙率、含水率與體外酶解率較正常脊髓均明顯提高(P<0.01)。見表1。正常脊髓細胞外基質結構致密，基質可見較多完整細胞核(圖2C、圖2D)。SCAS 基質結構呈疏松網絡狀，基質上可見極少量殘留細胞核(圖2E、圖2F)。

表1 SCAS與正常脊髓特性比較(%)

2.3 體外共培養

共培養1 d 時，NSCs 散在黏附于支架上(圖3A、圖3B)。共培養7 d 時，NSCs 在支架上逐漸分化為神經元和神經膠質細胞；神經元發育良好，胞體豐滿，形態各異，軸突清晰，部分神經元軸突間建立穩定聯系，形成軸突網絡(圖3C、圖3D)。共培養7 d 時，細胞良好黏附于支架上，神經膠質細胞在神經元之下，并分泌相關物質，可見神經元軸突間相互連接；神經元發育良好，軸突可深入支架基質孔隙中(圖3E、圖3F)。

圖1 NSCs鑒定(bar=100 μm)

圖2 正常脊髓與SCAS形態學觀察

3 討論

脊髓損傷康復臨床路徑包括急性期重建脊柱和神經減壓外科治療，以及亞急性和后期綜合康復[14]。隨著組織工程在各領域研究的日益廣泛，課題組提出脊髓組織工程5R 療法設想[15]，即先通過外科手術挽救(Rescue)脊髓功能，隨后引入脊髓組織工程，通過支架上種子細胞促進受損脊髓再生(Regeneration)和替代(Replacement)受損神經樣細胞，然后支架的橋接作用增強再髓鞘化(Remyelination)，在各種因素的協同作用下，獲得最大程度康復(Rehabilitation)。

圖3 細胞和支架體外共培養

由于脊髓神經的特殊性，選擇不同種類細胞與支架進行構建可能導致不同結果。胚胎干細胞與纖維蛋白支架構建導致細胞存活率降低，巨噬細胞浸潤增加[16]。在自組裝肽納米纖維支架中培養靈長類NSCs，分化率與常規培養無顯著性差異[17]。探索適宜的構建有重要意義。評估一項新構建的效果，通常先進行體外共培養，即將細胞種植在具有三維結構的支架上，使細胞在支架中遷移和生長，最終形成細胞-支架復合體。

NSCs 是一種組織特異性干細胞，來源于神經上皮，具有自我更新和定向分化的潛能。相較其他來源的干細胞，NSCs 更可能定向分化為神經譜系細胞[18]。將NSCs 與殼聚糖-明膠支架共培養，發現能促進NSCs 的黏附與生長，并向神經元與星形膠質細胞分化[19]。本研究以大腦皮質來源的NSCs 作為種子細胞，選用能保持干細胞特性的原代方式進行培養，發現NSCs 聚集成桑葚狀神經球，直徑可達150～300 μm，高于常規生物材料的內部孔隙間距，直接以神經球方式接種，難以將NSCs種植入支架內，也不便于觀察?？赏ㄟ^常規傳代時胰酶消化加機械吹打，將神經球吹散為單個細胞[20]，但由于消化時間過長或吹打過度等原因，導致NSCs 活力降低甚至凋亡。本課題組采用溫和的Acctuase 酶進行消化，獲得單個的細胞更利于傳代培養與后續共培養[21]。

已有研究表明[22]，SCAS 可以橋接大鼠受損脊髓，并促進損傷后軸突再生和運動功能康復。但相對于脫細胞真皮基質[23]，脊髓組織脫細胞研究較少，可能與脫細胞時間長(數十小時)、細胞脫去不徹底、基質結構破壞嚴重而引起失敗率較高有關[24]。目前國內外相關研究多采用物理結合化學萃取，輔以交聯劑對經歷長時間脫細胞過程而受損的基質結構進行交聯[25-26]。本課題組實際操作中發現，該方法存在制備時間過長、交聯劑可能存在化學毒性等問題。因此，本研究對SCAS 制備的方法進行優化，避免使用未知毒性的交聯劑，通過調節振蕩、凍融等相關參數，引入超聲振蕩與高低滲交替輔助裂解細胞法，大大縮短制備時間，并在脫除細胞的情況下最大限度保留基質結構。檢測表明，本研究優化的脫細胞法可去除絕大部分細胞，較完整保留細胞外基質成分與結構。

在此基礎上，本研究將穩定傳代的NSCs 與脫去細胞并保留完整基質的SCAS用于構建脊髓組織工程，觀察細胞在支架上的黏附、生長與分化情況，發現NSCs 在支架上黏附較好，可在支架上逐漸分化為胞體豐滿、形態各異、軸突清晰的神經元和神經膠質細胞，且分化后的神經元軸突間建立穩定聯系，形成的軸突網絡還可深入支架基質孔隙中。

綜上所述，本研究制備的SCAS 脫細胞較徹底，具有多通道空間結構，在體外共培養過程中適合NSCs 黏附、生長與分化，構建脊髓組織工程具備一定可行性。未來該類構建仍需要開展更多動物實驗評估移植后的效果與不良反應。相信以NSCs 與SCAS構建的脊髓組織工程能夠為康復醫學脊髓損傷領域提供新的應用可能。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。