早期運動聯(lián)合戊四氮對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能的效果及其機制

彭志鋒，張義平，張繼紅

山西大同大學醫(yī)學院生理系教研室，山西大同市037009

腦卒中是世界范圍內導致身體殘疾的主要原因之一，嚴重影響患者生活質量。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)營養(yǎng)素在神經(jīng)可塑性、神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)保護中起重要作用[1]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)素家族的一員，在腦卒中后運動功能恢復中起重要作用[2-3]。有氧運動可增加動物模型大腦皮質、紋狀體和海馬等腦區(qū)BDNF 表達[4-5]。另外，腦卒中也影響γ-氨基丁酸(gama-aminobutyric acid,GABA)介導的抑制功能。腦卒中小鼠半影區(qū)神經(jīng)元GABA 介導的肌張力抑制增強，注射GABA 受體拮抗劑可改善腦卒中小鼠的感覺運動功能[6]。本研究探討早期跑步運動和GABA 受體拮抗劑戊四氮(pentetrazol,PTZ)對缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能和BDNF表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性Sprague-Dawley 大鼠50 只，體質量240～280 g，購于山西醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK(晉)2009-0001。研究過程中對動物處理均按照國家頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》和山西大同大學醫(yī)學研究倫理委員會要求執(zhí)行。大鼠平均分為假手術組、模型組、運動組、戊四氮組和綜合組，每組10只。

1.2 實驗儀器和試劑

ZH-PT 型電動跑步機：安徽正華生物儀器設備有限公司。戊四氮、TTC 染料：美國SIGMA 公司。RNA 提取試劑盒、BDNF ELISA 試劑盒：天根生物科技有限公司?；蛱禺愋砸镉缮虾Ｋ剐派锟萍加邢薰竞铣?。

1.3 模型制備

除假手術組外的大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉60 mg/kg 麻醉。剪毛后頸正中切口，分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，線栓法行大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)。MCAO 后1 h拔出線栓，縫合皮膚。

假手術組同法手術，但不插入線栓。

1.4 干預方法

術前，運動組和綜合組跑步機上適應性訓練3 d，每天10 min。術后2 d，運動組和綜合組跑步機上訓練，速度15 m/min，每天30 min，共5 d；術后2 d，戊四氮組和綜合組每天腹腔注射戊四氮0.25 mg/kg，共5 d。

1.5 神經(jīng)行為學評價

術后7 d，采用5分制神經(jīng)分級評估神經(jīng)缺損。0，無明顯神經(jīng)缺損；1，右側前肢彎曲；2，當尾巴被牽拉時，右前肢肌力下降；3，當尾巴被牽拉時，向右轉圈；4，自發(fā)向右轉圈[7]。

1.6 TTC染色

行為學評分后，各組取5 只大鼠，迅速斷頭取腦，-20 ℃冰箱冷凍約15 min，冠狀切片，厚1.5 mm。腦片迅速放入1% TTC 磷酸鹽緩沖液中，37 ℃水浴避光孵育10 min。計算腦梗死體積[8]。

1.7 逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)

各組取5 只大鼠，心臟灌注處死。取大腦缺血半影區(qū)部分組織，RNA 提取試劑盒提取RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄生成cDNA。BDNF 特異性引物行RTPCR 擴增。產(chǎn)物電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，以假手術組為基礎計算相對光密度。

引物序列：上游5'-ATC CAC TGA GCA AAG CCG AAC-3'；下游5'-CAG CCC ATG CAA CCG AAG TA-3'。

1.8 ELISA

大腦缺血半影區(qū)部分組織勻漿，離心取上清，按照BDNF ELISA 試劑盒的步驟操作，492 nm 處測光密度，繪制標準曲線，以假手術組為基礎計算BDNF 相對濃度。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukeyt檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 神經(jīng)行為學評分

術后7 d，假手術組神經(jīng)行為學評分正常，模型組評分增高(P<0.05)；與模型組相比，運動組評分降低(P< 0.05)，綜合組評分進一步降低(P< 0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)行為學評分比較

2.2 腦梗死體積

假手術組無梗死，模型組有明顯局灶性梗死(P<0.05)；與模型組相比，運動組和戊四氮組腦梗死體積均降低(P<0.05)，綜合組腦梗死體積進一步降低(P<0.05)。見圖1、表2。

2.3 BDNF mRNA及蛋白表達

圖1 各組典型TTC染色

與假手術組相比，模型組BDNF mRNA 和蛋白表達均降低(P<0.05)；與模型組相比，運動組和戊四氮組BDNF 表達增高(P<0.05)，綜合組BDNF 表達進一步升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組檢測指標比較

3 討論

以GABA 為靶點的運動或藥物治療對腦卒中運動功能恢復有益[9]。BDNF 能增強突觸可塑性，如長時程增強，可能是腦卒中后恢復的潛在生物標志物[10-11]。腦卒中后學習記憶改善不僅伴有海馬BDNF 上調，也伴隨膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子上調[12-13]。GABA 受體拮抗劑可增加BDNF 表達[14]。有氧運動可增加動物模型腦區(qū)BDNF 表達[15-17]。本研究顯示，聯(lián)合采用跑步運動與低劑量戊四氮，比單獨干預更能促進腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能恢復，可能與上調大鼠缺血半影區(qū)BDNF表達水平有關。

Ca2+是眾多細胞信號傳導的關鍵調控因子[18]。Ca2+流入神經(jīng)元觸發(fā)環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMPresponse element binding protein,CREB)磷酸化，而CREB 是BDNF 轉錄激活的最重要調節(jié)因子之一[19]。戊四氮阻斷GABA 活性，并伴隨著Ca2+流入和CREB磷酸化[20]。運動可激活皮質神經(jīng)元，增強CREB 磷酸化[21]。

本研究選擇低劑量GABA 受體拮抗劑，以避免可能的副作用，如神經(jīng)毒性。本研究和以往研究中均未發(fā)現(xiàn)低劑量GABA 受體拮抗劑有明顯副作用，提示短期小劑量GABA 受體拮抗劑給藥的安全性[22]。以GABA 介導的突觸抑制為靶點，可為神經(jīng)藥理學和運動誘導神經(jīng)可塑性提供新的理論依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。