墻蘚屬(Tortula Hedw.)2種蘚類植物孢子萌發與原絲體發育特征研究

黃士良，顏 麗，金紅霞，王明維，王碧雪，李 琳，王振杰

(1.河北女子職業技術學院，石家莊 050091；2.河北外國語學院，石家莊 050091；3.河北師范大學 生命科學學院，石家莊 050024；4.河北工業職業技術學院，石家莊 050091)

目前，國內外對蘚類植物原絲體發育、配子體發生的相關研究還比較薄弱。國外Hedwig和Nishida是對蘚類植物原絲體發育研究比較早的兩位專家，對蘚類植物原絲體的發育研究奠定基礎[2]。此后，2011年，Katsumata等[3]研究細胞色素P450單加氧酶CYP78A亞家族在苔蘚原絲體生長和配子體形成中的作用；2016年，Ruiz等[4]研究藥用多年生苔蘚的原絲體懸浮培養；Duckett等[5]和Silvia等[6]對幾種苔蘚植物原絲體發育特點進行一系列試驗觀察。國內最早對苔蘚植物原絲體發育進行系統研究的學者是高謙等人。1986年，高謙等[7]研究蘚類植物孢子萌發和原絲體發育與苔蘚植物的各分類群之間的關系及其種系發生與系統演化。2009年，于淑玲[8]對北方美姿蘚(Timmiabavarica)的原絲體發育特征進行研究。2014年，魏志穎等[9]以山赤蘚(Syntrichiaruralis)嫩莖尖為外植體，研究山墻蘚的組織培養條件。自2002年以來，趙建成研究團隊開展蘚類植物孢子萌發和原絲體發育特征研究，他們的研究為中國蘚類植物發育學研究提供了重要的基礎資料[10-14]。

無疣墻蘚和中華墻蘚隸屬叢蘚科(Pottiaceae)墻蘚屬(TortulaHedw.)，該科蘚類植物多為旱生蘚類植物，生境多干旱、寒冷[1,15]。選擇墻蘚屬具有孢子體的2種蘚類植物，詳細觀察其孢子萌發、原絲體發育、配子體發生的過程，并系統分析該屬2種蘚類植物發育特征，以期從發育學的角度對灰蘚科植物系統分類、生態學研究探索一些分類新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自2種蘚類植物標本成熟孢蒴內的孢子，標本信息：(1)無疣墻蘚TortulamucronifoliaSchwaegr,黃士良N0044(HBNU)，2016年10月11日，河北省平山縣宅北鄉北滾龍溝(38°29′2.21″N，113°56′45.74″E)，海拔500 m，巖面薄土。(2)中華墻蘚TortulasinensiaBroth.,曹珍N0033(HBNU)，2017年8月16日，河北省平山縣宅北鄉北滾龍溝(N 38°29′ 7.87″,E 113°56′11.08″)，海拔650 m，巖面薄土。憑證標本存放于河北師范大學植物標本館 (HBNU)。

1.2 試驗方法

采用改良 Knop 營養液的固體培養基，基質pH 7.0。改良Knop營養液配方為:1 g/L Ca(NO3)2·4H2O+250 mg/L KNO3+ 250 mg/L KH2PO4+250 mg/L MgSO4·7H2O+ 3 mg/L ZnSO4·7H2O+12.5 mg/L FeSO4·7H2O+微量NaNO3，用蒸餾水補足 1 L。在改良Knop營養液中加入2%瓊脂，加熱熔化后倒入60 mm的培養皿中制成固體培養基[12-13]。

1.3 試驗步驟

培養基的制備：試驗組按“1.2”的配方，在一定量的改良Knop營養液中加入適量瓊脂，使其濃度為2%，加熱熔化后，倒入60 mm的培養皿中，凝固后即可使用[13，15]。

孢子懸液的制備：把孢蒴浸入75%的酒精溶液中，20 s后取出，并在無菌蒸餾水中清洗5次；然后，用鑷子和解剖針將孢子取出并散入無菌蒸餾水中，制成適當濃度的孢子懸液[13，15]。

用吸管將稀釋的孢子懸液接種于培養基上。

培養皿加蓋后放在光照培養箱中培養。溫度23 ℃±2 ℃,相對濕度大于80%，光照強度 24 μmol/(m2·s)，光照時間12 h/d。

自接種培養之日起，每天定時鏡檢孢子發育情況，詳細記錄個體的發育狀況，并進行顯微照相及繪圖。

在對信息化教學進行反思過程中，從最初對信息化教學的盲目崇拜到理性思考，再到跳出媒體的框框，關注整個教學過程，再到關注師幼互動及其情感交流。在不斷地應用和反思中對信息化教學的認識也更加深入。具體如下：

2 結果與分析

生物顯微鏡下觀察，無疣墻蘚和中華墻蘚的孢子均為球形或橢圓形的單細胞孢子，棕綠色，直徑為10～20 μm。通過室內人工培養，兩種蘚類植物生活史中單倍配子體發育分為孢子吸水膨脹萌發過程，原絲體發育過程，配子體發生過程3個階段[11,15]。

2.1 孢子萌發過程

2種蘚類植物的孢子吸水膨脹萌發階段可以劃分兩個明顯發育期：(1)孢子吸水膨脹期。室內接種孢子12 h后觀察，孢子內葉綠體顏色加深，體積開始緩慢增加。24 h顯微鏡下觀察，2種蘚類植物孢子內葉綠體的數目不斷增多，無疣墻蘚孢子直徑達到15～20 μm(圖1-1)；中華墻蘚孢子吸水后直徑達到25～30 μm(圖1-2)，吸水后膨脹的體積大于無疣墻蘚孢子。(2)破壁萌發期。 36 h時，無疣墻蘚有少數孢子開始破壁萌發(圖1-3)，形成綠絲體原始細胞(Chloronema primitive cell)，并不斷伸長。72 h時，無疣墻蘚孢子萌發率為74.1%，萌發極向為1～2極(圖1-5)，單極萌發達93%。36 h時，中華墻蘚孢子仍處在吸水膨脹期。72 h時，中華墻蘚孢子萌發率為 27.6%，萌發極向處在單極萌發階段，孢子萌發后形成塊狀原絲體細胞(Massive protonema cell)(圖1-4)。90 h時，無疣墻蘚和中華墻蘚孢子萌發率分別為83.3%和84.3%，中華墻蘚萌發率快速提升。兩種蘚類植物在孢子萌發初期沒有產生初生假根(Primary rhizoid)和初生軸絲體(Primary caulonema)。 從2種蘚類植物孢子萌發過程看，孢子在萌發初期，產生的極向少。中華墻蘚的孢子萌發速度明顯低于無疣墻蘚的孢子萌發 速度。

2.2 原絲體發育過程

2.2.1 無疣墻蘚原絲體發育過程 4 d時，無疣墻蘚孢子全部萌發，萌發極向為1～2極，兩極萌發率達4%，綠絲體原始細胞緩慢伸長生長，測量長度達到110 μm(圖1-6)。6 d時，無疣墻蘚孢子兩極萌發率達12.5%，兩極萌發率還在繼續擴大，同時部分綠絲體原始細胞開始分化出具有短圓柱狀細胞的一級側枝，綠絲體分化生長長度已達300 μm(圖1-8)。7 d時，無疣墻蘚綠絲體分枝明顯增多，靠近綠絲體原始細胞處的綠絲體細胞直徑開始逐漸變大達到10 μm，綠絲體前段的細胞變化不大，保持在5～7 μm。8 d時，無疣墻蘚有30%的主軸綠絲體開始彎曲生長，綠絲體前段開始產生分枝(圖1-9)，分枝直徑20μm，分枝主要集中在離綠絲體原始細胞500 μm內。10 d時，無疣墻蘚綠絲體頂端開始分化產生具有斜壁細胞的軸絲體(Caulonema)(圖1-10)，綠絲體細胞上開始分化產生短圓柱狀或球狀綠絲體細胞，細胞長度50 μm，直徑為13 μm。培養11 d時，無疣墻蘚的綠絲體系統葉綠體的數量明顯增多，在主軸上分化產生的短圓柱狀或球狀綠絲體細胞逐漸伸長生長，開始有2～3個二級側枝出現，側枝細胞長度40 μm，直徑為22 μm(圖1-11)，但分化速度比較緩慢，分化產生的二級側枝的綠絲體細胞形態仍為短圓柱狀。12 d時，無疣墻蘚綠絲體生長發育速度加快，綠絲體系統交織成網狀(圖1-12)，以綠絲體原始細胞為中心，綠絲體向四周散射生長。綠絲體頂端分化產生軸絲體細胞，軸絲體細胞伸長生長速度是綠絲體細胞生長速度的2～3倍。

2.2.2 中華墻蘚原絲體發育過程 5 d時，中華墻蘚萌發極向出現2～3極，綠絲體原始細胞生長緩慢，塊狀原絲體體積增大(圖1-7)。8 d時，中華墻蘚塊狀原絲體在體積增大的同時，緩慢伸長生長，并開始產生無序綠絲體分枝(圖1-13)，分枝中有一個分枝伸長生長較快。10 d時，觀察中華墻蘚塊狀原絲體依然緩慢生長，在塊狀原絲體上產生的絲狀綠絲體緩慢伸長生長(圖1-14)。15 d時，中華墻蘚還處在原絲體發育階段。中華墻蘚塊狀原絲體體積膨脹速度加快，直徑達到150～200 μm，開始產生氣生側枝，氣生側枝為絲狀原絲體，細胞內葉綠體很少，向基質外側生長。同時，在塊狀原絲體上產生的綠絲體分枝中，有 1～2個綠絲體分枝迅速伸長生長(圖1-15)。 19 d時，從中華墻蘚塊狀原絲體上產生的一枝綠絲體分枝伸長速度明顯增快，成為主軸綠絲體，主軸綠絲體前段開始分化產生軸絲體(圖1-16)。25 d時，分化產生的軸絲體生長速度快于綠絲體，同時軸絲體細胞開始褐化，軸絲體上開始分化產生綠絲體細胞，而且在軸絲體產生綠絲體細胞處的節點上，再次分化產生塊狀原絲體，并進一步分化產生成簇狀生長的綠絲體(圖1-17)。

2.2.3 原絲體發育特征與生境相關性分析 墻蘚屬2種蘚類植物原絲體發育階段出現的性狀特征與其生境有著密切的關系。2種蘚類植物的孢子在萌發初期，產生的極向少，在原絲體生長發育階段分枝少，分枝生長的長度有限，多數在300～500 μm以內。中華墻蘚孢子萌發后，首先產生塊狀原絲體，綠絲體發育更為緩慢。到配子體原始細胞產生時，無疣墻蘚整個原絲體系統的生長擴散以綠絲體基細胞為中心，在沒有形成復雜的原絲體網絡系統時，便快速進入配子體分化階段。中華墻蘚到配子體發生時也沒有形成網絡狀發達的絲狀原絲體系統。2種蘚類植物均未形成網絡狀原絲體系統，這種現象和野外生境應該有緊密相關性，墻蘚屬多為旱生型蘚類植物，本試驗培育的2種蘚類植物，采集生境為干燥石灰巖或鈣土，其生存條件干旱少水，極大地影響原絲體發育。無疣墻蘚植物在室內環境條件適宜時，孢子會快速萌發，并進入原絲體發育階段，產生的原絲體為短圓柱狀細胞結構，這是防御干旱環境的性狀特征。中華墻蘚則采用產生塊狀原絲體來應對干旱環境。多數旱生型蘚類植物為了應對干旱環境，會主動調整發育周期，減少原絲體發育階段時間，產生片狀、塊狀或泡狀原絲體，還會采取快速產生配子體和孢子體，完成受精作用，達到短時間內完成生活史的目的[16-17]，即使在室內優越的條件下，其發育過程中依然出現適應野外生境的發育性狀特征。

2.3 配子體發生過程

2.3.1 無疣墻蘚配子體發生過程 13～14 d時，無疣墻蘚綠絲體基部細胞和軸絲體細胞上開始分化產生泡狀結構的配子體原始細胞(Gametophyte initial cell)(圖1-18)，細胞內部葉綠體較多。培養17 d后，無疣墻蘚配子體原始細胞逐漸分化成為桑葚狀群體細胞結構，以不對稱分裂(Asymmertric division)的方式進行快速分化產生分生細胞團(Meristem)，桑葚狀群體細胞結構基部分化產生不含葉綠體的絲狀的假根，假根呈正向地性，假根生長速度很快(圖1-19)。在20 d開始時，無疣墻蘚配子體原始細胞開始分化產生的同時，部分綠絲體細胞的細胞壁逐漸消失，繼續培養2 d后，綠絲體細胞發生縊裂，形成細胞數目不等的多個斷裂原絲體段，各自獨立生長(圖1-20)。從22 d開始，無疣墻蘚配子體原始細胞的數量快速繼續增多，在綠絲體主軸上產生大量配子體原始細胞，并快速分化成桑葚狀群體細胞結構，同時軸絲體細胞發生褐化(圖1-21,1-22)。24 d時觀察，無疣墻蘚桑葚狀結構的分生細胞團開始快速分化產生幼葉。30 d時，無疣墻蘚已分化產生出5～8片幼葉(圖1-23)

2.3.2 中華墻蘚配子體發生過程 24 d時，中華墻蘚塊狀原絲體體積還在增加，產生氣生原絲體，伸向基質外側(圖1-24)，從軸絲體上開始分化產生配子體原始細胞(圖1-25)。26 d時，中華墻蘚配子體原始細胞分化產生桑葚狀群體細胞結構，此時，褐化的軸絲體上每個斜壁細胞處都產生綠絲體分枝，綠絲體分枝很快產生側枝。產生配子體后，中華墻蘚的綠絲體分枝生長速度變慢。30 d時，觀察中華墻蘚配子體只分化產生2～3片幼葉(圖1-26)。

2.3.3 2種蘚類植物配子體發生特點分析 從配子體原始細胞產生的時間看，無疣墻蘚配子體發生的時間比中華墻蘚配子體發生的時間快6 d左右。在配子體發育初期，無疣墻蘚配子體原始細胞產生的數量明顯比中華墻蘚的數量多。在配子體發育中后期，2種蘚類植物的原絲體發育速度也逐漸變慢。在試驗中，中華墻蘚在原絲體發育階段產生塊狀原絲體，可能因此推遲了中華墻蘚原絲體系統發育速度和配子體分化產生的 時間。

3 討論與結論

3.1 兩種蘚類植物孢子萌發型與系統發育

3.1.1 孢子萌發型 蘚類植物穩定的發育性狀是確定孢子萌發型的關鍵因素。無疣墻蘚孢子為壁外1～3極萌發，具有長圓柱狀的絲狀原絲體；綠絲體上分化產生絲狀軸絲體；在綠絲體或軸絲體上分化產生配子體原始細胞。中華墻蘚孢子為壁外萌發，在壁外綠絲體原始細胞首先分化產生塊狀原絲體，在塊狀原絲體上分化產生綠絲體和軸絲體，其軸絲體在發育中期易發生褐化。中華墻蘚配子體原始細胞在塊狀原絲體上產生，也可以在軸絲體上分化產生。根據以上發育特點，參照Nishida對蘚類植物發育類型劃分標準，確定無疣墻蘚和中華墻蘚的孢子萌發型分別為真蘚型(Bryum-type)和縮葉蘚型(Ptychomitrium-type)[2,15-17]。

3.1.2 孢子萌發型與其系統發育地位 依據蘚類植物外部形態特征和穩定的發育特征，分析其演化地位將更為科學。在原絲體的性狀演化順序上，塊狀原絲體與絲狀原絲體相比，塊狀原絲體特征是相對原始的，絲狀原絲體表現出原絲體發育形態中的最高級的性狀特征[2]。研究的2種墻蘚屬蘚類植物中，中華墻蘚原絲體在發育過程中出現塊狀原絲體，說明與無疣墻蘚相比，其演化位置相對原始，即萌發型為縮葉蘚型的蘚類植物，從發育學的角度看，其發育性狀較為原始。2種墻蘚屬植物在原絲體發育過程中都是以絲狀原絲體為主體，無疣墻蘚的絲狀原絲體系統明顯比中華墻蘚的原絲體系統發達。在培養條件優越的環境中，兩種蘚類植物在原絲體發育階段依然出現短圓柱狀原絲體和塊狀原絲體，說明這兩種發育性狀在演化上是穩定的，不會因生境條件改變，隨時調整原絲體發育形狀，改變孢子萌發型，這為本屬蘚類植物原絲體發育演化路線向著絲狀原絲體發展趨勢提供了有力佐證[12,18-20]。王利松等[21]遵循Frey和Stech的系統，將中華墻蘚從叢蘚科墻蘚屬劃分到赤蘚屬(SyntrichiaBrid.),本研究從兩種蘚類植物孢子萌發型的差異性角度分析，支持對該種的劃分。塊狀原絲體是蘚類植物為了適應干旱環境而產生的一種適應機制，可以作為一種分類學的特征，但不能因一個發育性狀特征便決定該種演化地位高，還需要更多經典分類學的性狀作依據。

3.2 孢子萌發型與生殖策略

從蘚類植物生境的多樣性可以看出生殖策略的多樣性。面對高大的被子植物，蘚類植物的生境選擇存在壓力，因此，身體矮小的蘚類植物為了擴大種群數量，保持了生殖策略的多樣性，從而擁有更強大的適應性。作為同一屬的蘚類植物，孢子萌發型卻存在較大差異性，萌發型為縮葉蘚型的中華墻蘚在原絲體發育階段初期產生了塊狀原絲體，雖然這種性狀表明是對較為干旱環境的適應結果，但在室內培養階段水分充足，其發育過程依然出現塊狀原絲體。說明蘚類植物在演化過程中，為了抵御極端環境，生活史中產生了塊狀原絲體發育階段，順利的讓蘚類植物過渡到配子體發生時期，從而保障了生活史的順利完成，這一防御性狀也被保留下來。如在配子體發育階段，芽孢墻蘚(Tortulapagorum)在配子體上產生芽孢，以抵御不良環境，這與無疣墻蘚的短圓柱狀原絲體、中華墻蘚原絲體發育階段產生的塊狀原絲體采取的都是相同生殖策略。

墻蘚屬2種蘚類植物在試驗條件下，均完成從孢子萌發到原絲體發育，再到配子體產生的過程。實驗室培養條件優越，水分充足，卻很少蘚類植物在試驗條件下產生孢子體。表明在外界環境優越，尤其是水分充足的條件下，蘚類植物生殖策略選擇r型生態對策，選擇通過無性生殖達到擴大種群目的，避免發生有性生殖帶來的生物能量過度消耗[12,16-17]。從蘚類植物生活史完成的時間長短看，本研究認為存在兩種情況，一是因為生長條件優越，蘚類植物直接采用無性繁殖直接達到了擴大種群數量的目的，而不用采用產生孢子體，完成生活史，或者推遲產生孢子體的時間；二是由于蘚類植物在發育過程中，遇到了極端環境，阻礙了配子體或孢子體的分化產生，等生長條件允許時，繼續生長，來完成生活史的每個階段。中華墻蘚原絲體發育階段產生的塊狀原絲體是對極端不良環境的適應，減緩了生長發育的速度，因此，在優越條件下培養時，因產生塊狀原絲體，同樣使得配子體發生的時間推遲。這一點在試驗中得到驗證，如無疣墻蘚配子體原始細胞發生的時間為20 d，而中華墻蘚的配子體原始細胞發生時間為26 d，中華墻蘚的配子體發生時間，因產生塊狀原絲體，發育時間比無疣墻蘚推遲6 d。

綜上所述，墻蘚屬2種蘚類植物孢子均為壁外萌發，無疣墻蘚綠絲體細胞為短圓柱狀細胞，能分化產生軸絲體。配子體在綠絲體和軸絲體上均能產生。中華墻蘚孢子萌發在壁外產生塊狀原絲體，絲狀綠絲體在塊狀原絲體上產生，分化產生軸絲體。無疣墻蘚和中華墻蘚配子體分別在綠絲體上和軸絲體、塊狀原絲體上產生。參照Nishida對蘚類植物孢子萌發和原絲體發育類型劃分標準，墻蘚屬無疣墻蘚和中華墻蘚原絲體發育類型分別為真蘚型和縮葉蘚型。2種蘚類植物的發育特征為墻蘚屬植物的分類學研究提供了一些有益數據。