METTL21C蛋白的序列特征、三維結(jié)構(gòu)及分子進化

王珊珊，任艷艷，馬 宇，路宏朝，張 濤，王 令

(陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西漢中 723001)

蛋白質(zhì)的甲基化修飾是指將甲基轉(zhuǎn)移至特定氨基酸殘基上共價結(jié)合的過程，是最常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一。甲基化修飾是一種極為精細和專一的活性調(diào)節(jié)方式[1]，參與真核生物和原核生物的多種細胞進程，如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細胞定位、核糖體裝配、RNA加工、蛋白質(zhì)相互作用、細胞內(nèi)信號傳導等[2]。甲基化修飾由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶(Methyltransferases)催化發(fā)生[3]。目前，已知大多數(shù)甲基化反應發(fā)生在蛋白質(zhì)的賴氨酸和精氨酸位點上，且存在不同的甲基化類型，如賴氨酸殘基可發(fā)生單甲基化、二甲基化和三甲基化[4]。甲基轉(zhuǎn)移酶樣21(Methyltransferase like21，METTL21)是甲基轉(zhuǎn)移酶家族的一類遠親成員，包括METTL21A、METTL21B、METTL21C和METTL21D四個成員[5]。其中，METTL21C具有蛋白質(zhì)賴氨酸N端甲基轉(zhuǎn)移酶活性，涉及多種細胞功能和生物學過程的翻譯后修飾[6]。已有研究基于GWAS(Genome wide-association studies)分析發(fā)現(xiàn)METTL21C基因在高品質(zhì)牛肉中表達水平較高[7]；METTL21C基因突變后與人類肌肉減少癥有關(guān)，可能通過調(diào)節(jié)鈣濃度平衡促進肌細胞的分化[8]；Wiederstein等[9]以小鼠為研究模型，發(fā)現(xiàn)METTL21C蛋白的表達與I型慢肌纖維的比例呈正相關(guān)。由此可見，METTL21C作為甲基轉(zhuǎn)移酶成員可能參與機體多種生命活動過程，發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

隨著新一代DNA測序技術(shù)的發(fā)展和應用，越來越多物種的METTL21C基因及其編碼蛋白得以發(fā)現(xiàn)。盡管METTL21C是進化上高度保守的蛋白家族，然而不同物種METTL21C蛋白的催化機制和生理功能可能不同。因此，對METTL21C家族蛋白進行系統(tǒng)的生物信息學分析，對了解該家族成員的分子進化和生理功能非常重要。然而迄今為止，對METTL21C的研究報道非常有限，且主要集中于單一物種METTL21C的表達和功能分析，尚無該家族全面系統(tǒng)的分子進化的報道。本試驗在蛋白質(zhì)信息數(shù)據(jù)庫UniprotKB中選取了36個代表物種的METTL21C蛋白，利用生物信息學對蛋白理化性質(zhì)、motif序列、系統(tǒng)進化樹、空間結(jié)構(gòu)和蛋白互作網(wǎng)絡等進行分析，探討不同物種METTL21C蛋白的序列特征、空間結(jié)構(gòu)及分子進化，為進一步深入研究METTL21C參與和調(diào)控多種細胞進程奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 METTL21C蛋白數(shù)據(jù)的收集及分析

利用蛋白質(zhì)信息數(shù)據(jù)庫UniProtKB(http://www.uniprot.org/)，以METTL21C為關(guān)鍵詞搜索，選擇具有代表性物種的METTL21C蛋白，下載其一級序列信息。借助蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預測工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對METTL21C家族蛋白成員進行分子量、等電點、相對分子質(zhì)量、親疏水性等理化參數(shù)進行分析預測[10]。

1.2 蛋白多序列比對及分子進化樹構(gòu)建

利用在線多序列比對工具Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/)，對不同物種METTL21C蛋白的一級結(jié)構(gòu)進行多序列比對，將比對結(jié)果載入ENDscript/ESPript 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi/)中進行作圖與分析[11]。將多序列比對結(jié)果導入系統(tǒng)進化樹構(gòu)建軟件MEGA 7.0[12]，采用鄰位歸并法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建不同物種METTL21C蛋白的分子進化樹，結(jié)果載入iTOL(http://itol.embl.de/)進行處理。

1.3 蛋白Motif分析和三維結(jié)構(gòu)預測

基于在線motif分析工具MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)，對不同物種METTL21C蛋白進行motif分析。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)中搜索已解析METTL21C的空間結(jié)構(gòu)。利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測服務器SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org /interactive)對未解析三維結(jié)構(gòu)的蛋白進行同源建模。采用LigPlot+軟件分析蛋白質(zhì)與配體之間的相互作用[13]。通過PyMOL軟件進行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的展示和分析[14]。

1.4 METTL21C蛋白互作網(wǎng)絡預測

采用String在線軟件(http://string-db.org/)預測人METTL21C與其他蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同物種METTL21C蛋白的理化特性分析

在UniProtKB中搜索METTL21C蛋白，共獲得185個相關(guān)結(jié)果，其中絕大多數(shù)來源于脊椎動物。選擇36種代表物種的METTL21C蛋白，哺乳動物有21種，其中陸地哺乳動物包括人、黑猩猩、小鼠、大鼠、川金絲猴、牛、家犬、家貓、豬、綿羊、山羊、大熊貓、北極熊、非洲象、火狐、馬、雜交牛和兔，海洋哺乳動物長江豚和抹香鯨，以及原始哺乳動物鴨嘴獸；鳥類共10種，包括原雞、火雞、北部野鴨、巖鴿、帝企鵝、朱鹮、短嘴鴉、啄木鳥、大杜鵑和火烈鳥；爬行類共3種，包括揚子鱷、中華鱉和變色龍；魚類共2種，包括鬼鯊和大西洋鮭魚。

借助ProtParam對不同物種METTL21C蛋白進行理化參數(shù)分析(表1)。一級序列中氨基酸殘基個數(shù)差異較大，為190～335，平均長度為254個殘基，其中序列最短的是帝企鵝，最長的是馬。分子質(zhì)量為21 531.63～37 217.35 u，平均分子質(zhì)量為28 557.79 u。理論等電點為4.54～5.86，平均等電點為4.93，說明不同物種METTL21C均為偏酸性蛋白。帶負電荷氨基酸(Asp + Glu)的個數(shù)為22～44，帶正電荷氨基酸(Arg + Lys)的個數(shù)為13～34。不穩(wěn)定指數(shù)為34.93～55.83，其中低于40.00的僅有8個，表征為較穩(wěn)定的蛋白，其余為不穩(wěn)定蛋白。脂肪指數(shù)為76.13～ 103.61，總親水性平均系數(shù)為-0.516～0.045，絕大多數(shù)為親水性蛋白，僅帝企鵝和短嘴鴉METTL21C蛋白的親水性平均系數(shù)分別0.030和 0.045，表現(xiàn)為弱疏水性蛋白。

表1 不同物種METTL21C蛋白理化性質(zhì)分析

2.2 不同物種METTL21C蛋白的多序列比對及進化樹分析

通過多序列比對發(fā)現(xiàn)，不同物種METTL21C的N末端氨基酸序列差異較大，與人、小鼠、大鼠等哺乳動物相比，馬和兔METTL21C蛋白在N端增加了額外的氨基酸序列。與哺乳動物相比，大杜鵑、帝企鵝、朱鹮等鳥類METTL21C蛋白在N端有大段序列缺失。然而，不同物種METTL21C在52～259區(qū)氨基酸序列相似度較高，特別是在117～141區(qū)有多個連續(xù)的絕對保守位點(圖1)，其中亮氨酸(Leu，L)、谷氨酸(Glu，E)和甘氨酸(Gly，G)的出現(xiàn)頻率較高，這可能提示這些氨基酸在分子進化中對維持METTL21C蛋白的穩(wěn)定性和生物功能有重要意義。

在多序列比對的基礎上，通過鄰位歸并法創(chuàng)建不同物種METTL21C蛋白的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示進化樹共分為4支。哺乳類為第一支，包括人、黑猩猩、豬等21種。其中，人METTL21C與黑猩猩和川金絲猴的親緣關(guān)系最近，其次為豬；牛與雜交牛、山羊與綿羊、家犬與紅狐、北極熊與大熊貓、海洋動物長江豚與抹香鯨的親緣關(guān)系較近；原始卵生哺乳動物鴨嘴獸METTL21C與其他胎生哺乳動物親緣性較遠。爬行類為第二支，揚子鱷與中華鱉親緣關(guān)系較近，變色龍為相對獨立的小分枝，親緣關(guān)系較遠。鳥類為第三支，原雞與火雞、啄木鳥與朱鹮、火烈鳥與大杜鵑的親緣關(guān)系較近，北部野鴨、短嘴鴉、巖鴿和帝企鵝分別為獨立的小分枝，與其他鳥類親緣關(guān)系較遠。魚類為第四支，鬼鯊和大西洋鮭魚與其他物種的親緣關(guān)系較遠，處于相對獨立進化的蛋白(圖2)。

2.3 不同物種METTL21C蛋白的Motif分析

采用MEME分析不同物種METTL21C蛋白的一級序列，共獲得10個motif(圖3)。Motif 1和motif 2評分最高，序列長達50個氨基酸殘基，是所有物種METTL21C蛋白最保守的區(qū)域，除大西洋鮭魚的motif 1內(nèi)部多余兩個氨基酸位點外，其他物種中均含有motif 1和motif 2序列。Motif 3包含41個氨基酸殘基，在不同物種中有絕對保守的位點，也有相對可變的區(qū)域，32種METTL21C蛋白含有motif 3，在一些鳥類(帝企鵝和短嘴鴉)中有部分序列的缺失，魚類(鬼鯊和大西洋鮭魚)中無motif 3結(jié)構(gòu)。36種METTL21C均含有motif 4和motif 5，氨基酸序列長度分別為30和15，絕對保守和部分保守位點交替出現(xiàn)，推測此區(qū)域可能定位于蛋白的外側(cè)，不同物種METTL21C在進化過程中，在保留基本構(gòu)象的基礎上，一些氨基酸發(fā)生了適應性突變，使構(gòu)象具有一定的柔性，以利于蛋白空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和底物識別催化。Motif 7位于METTL21C的N末端，主要在哺乳動物中出現(xiàn)(17種)，而鳥類、爬行類和魚類中無此序列。Motif 10和motif 8依次位于motif 7之后，也主要在哺乳動物METTL21C中出現(xiàn)，而在鳥類和爬行類中無此motif 序列，說明METTL21C蛋白在進化過程中，N端序列差異較大，哺乳動物保留了這些片段，而鳥類有大段缺失。Motif 6和motif 9序列位于METTL21C的C末端，雖有部分位點的重復，但序列差異較大，motif 6多在哺乳類、爬行類和部分鳥類METTL21C中出現(xiàn)，而motif 9多在鳥類中出現(xiàn)，表明METTL21C蛋白的C端序列，在進化過程中也表現(xiàn)出一定程度的差異。

2.4 METTL21C蛋白三維結(jié)構(gòu)的分析

目前，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB PDB中僅公布了人METTL21C蛋白的三維結(jié)構(gòu)(PDB登錄號：4MTL)。人METTL21C的整體結(jié)構(gòu)為同型二聚體，由兩條多肽鏈組成，A鏈中包含57～264殘基的空間排布，B鏈中包含45～263殘基的空間排布，N端結(jié)構(gòu)的缺失推測可能是由于METTL21C N端有大段無序結(jié)構(gòu)，自由度較高，構(gòu)象變化較大，導致無法通過X射線晶體衍射法精確解析此區(qū)域的構(gòu)象。A鏈和B鏈均與配體S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine，SAH)結(jié)合，定位于疏水空腔中(圖4-A)。每個單體由9個β-折疊片段(β1～β9)和 6個α-螺旋片段(α1～α6)交替組成，反平行折疊的β1和β2位于N端，β3～β9位于結(jié)構(gòu)內(nèi)部，α1～α3和 α4～α6分別位于β3～β9折疊結(jié)構(gòu)的兩側(cè)，形成特殊的松散內(nèi)核、緊密表面的空間結(jié)構(gòu)(圖4-B)。

在人METTL21C與配體SAH的復合體結(jié)構(gòu)中，SAH定位于疏水口袋中，與氨基酸殘基Trp92、Gly120、Trp172和Ser193形成氫鍵。在A鏈中SAH與Ala21、Tyr87、Gly88、Val91、Ala95、Gly122、Asp141、Leu142、Val145、Leu170、Val171、Asp194、Tyr197、Phe201存在疏水相互作用；在B鏈中SAH與Val91、Ala95、Ala121、Gly122、Asp141、Leu142、Leu170、Val171、Asp194、Tyr200、Ser228存在疏水相互作用，以維系SAH的構(gòu)象(圖 5)。

以人METTL21C為模板，利用SWISS-MODEL同源建模獲得其他物種METTL21C的空間結(jié)構(gòu)。其中，黑猩猩與人METTL21C蛋白的序列一致性最高，達99.18%；大西洋鮭魚和鬼鯊與人METTL21C蛋白的序列一致性最低，分別為49.53%和53.00%，表明同源建模獲得的三維結(jié)構(gòu)可信度較高。通過比較不同哺乳動物METTL21C的空間結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)絕大部分區(qū)域的構(gòu)象近乎完全重疊，僅有局部肽段有一定程度的差異，黑猩猩與人METTL21C結(jié)構(gòu)差異主要體現(xiàn)在N端區(qū)域，呈反平行式排列的β1和β2結(jié)構(gòu)更長(圖6-A)；與人METTL21C相比，抹香鯨METTL21C在β8與β9之間的構(gòu)象由β-轉(zhuǎn)角變?yōu)棣?螺旋(圖6-B)，鴨嘴獸METTL21C的氨基酸殘基個數(shù)相對較少，在N端有大部分缺失，同時β8和β9的構(gòu)象更短，局部轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲(圖6-C)。通過比較人與其他非哺乳動物METTL21C的空間結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)大杜鵑與揚子鱷的結(jié)構(gòu)類似，大西洋鮭魚與抹香鯨的結(jié)構(gòu)類似，與人METTL21C的結(jié)構(gòu)差異均主要體現(xiàn)在β1～β2和β8～β9區(qū)域(圖6-D～F)。

2.5 人METTL21C蛋白互作網(wǎng)絡預測分析

String數(shù)據(jù)庫基于試驗數(shù)據(jù)、文本挖掘、綜合其他數(shù)據(jù)庫資源，以及生物信息學分析(基因臨近、基因融合、基因共存、共表達、同源性)進行綜合評分，預測蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡。以人METTL21C為中心的直接相關(guān)蛋白有11種。其中FAM86A的評分最高(0.804)，作為甲基轉(zhuǎn)移酶能夠三甲基化修飾真核延伸因子2(EEF2)的Lys-525位點，但目前沒有明確報道FAM86A與METTL21C具有相互作用，僅推測可能在其他物種中METTL21C作為同源蛋白具有潛在的相關(guān)性[15]。其次是甲基轉(zhuǎn)移酶METTL18 (0.798)、METTL20(0.787)[16]、METTL10 (0.725)[17]和鉀電壓門控通道亞家族A成員KCNA2(0.674)[18]，在相關(guān)文獻中與METTL21C共同出現(xiàn)，并在其他物種中存在共同表達。BMP10[18]、SUCNR1[18]、CAMKMT、N6AMT2、FAM173A、EEF2的評分較低，僅在文獻中與METTL21C共同出現(xiàn)。此外，有9種蛋白與METTL21C間接相關(guān)。其中BMPR1A、NKX2-5、BMPR2和ACVRL1蛋白為一簇，與BMP10直接相關(guān)；KCNAB1、KCNAB2、KCNAB3、CTTN蛋白為一簇，與KCNA2直接相關(guān)(圖7)。

3 結(jié)論與討論

甲基轉(zhuǎn)移酶METTL21C參與多種細胞進程的翻譯后修飾，在生命活動中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[19]。基于蛋白質(zhì)信息數(shù)據(jù)庫UniProtKB已公布的蛋白信息，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)METTL21C來源于脊椎動物，特別是哺乳類、鳥類和魚類，說明METTL21C在脊椎動物中普遍存在，是一個較為古老的蛋白。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在略陽烏雞的多種組織中METTL21C均有表達，在心肌和骨骼肌中表達量最高，推測METTL21C可能在肌肉生長發(fā)育中發(fā)揮重要的生物學功能[20-21]。

36個代表物種METTL21C蛋白的理化參數(shù)分析結(jié)果顯示，一級序列中氨基酸殘基個數(shù)差異較大，平均為254個氨基酸殘基，大多為偏酸親水性蛋白。系統(tǒng)進化樹分為哺乳類、爬行類、鳥類和魚類共4支，與物種的親緣進化關(guān)系基本吻合，表明METTL21C的分子進化過程符合物種的進化規(guī)律。多序列比對和MEME分析顯示36種METTL21C的平均一致性為16.52%，平均相似度為62.30%，一級結(jié)構(gòu)中有多段高度保守序列，10個motif幾乎覆蓋了全長多肽鏈，大多都含有motif 1～motif 5，表明這些序列是METTL21C家族執(zhí)行重要生物功能或組成結(jié)構(gòu)不可缺少的部分。但N端序列差異較大，哺乳動物中含特有的motif 7、motif 8和motif 10，在進化過程中作為獨立的一個較大分支；而在多種鳥類中有大段缺失，推測在進化過程中丟棄了冗余序列以適應在空中飛行；魚類作為最早出現(xiàn)的脊椎動物分支，N端序列與其他物種的差異較大。空間結(jié)構(gòu)對比發(fā)現(xiàn)，不同物種METTL21C的構(gòu)象絕大部分區(qū)域近乎完全重疊，僅有自由度較高的局部肽段有一定程度的差異，如轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲區(qū)。表明不同物種METTL21C在進化過程中雖然一級序列有一定的差異，但是空間構(gòu)象極為相似，高度保守。

以人METTL21C為中心的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡，直接相關(guān)的11種蛋白質(zhì)中，主要是與其他甲基轉(zhuǎn)移酶在相關(guān)文獻中共同出現(xiàn)，或在其他物種中共同表達，如FAM86A能甲基化修飾真核延伸因子2 (EEF2)[22]，METTL10能甲基化修飾真核延伸因子α (eEF1A)，從而影響蛋白質(zhì)的翻譯與表達[23]。METTL20作為線粒體賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，選擇性甲基化修飾黃素蛋白ETFβ，并對其功能起負調(diào)節(jié)作用[24]。與METTL21C有較弱相互關(guān)系的KCNA2和BMP10，作為核心蛋白又與其他多種蛋白直接相關(guān)。說明METTL21C作為蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡中心，直接或間接參與多種細胞進程，從而影響機體的生命活動。目前在基因水平已有報道，METTL21C基因在高pH牛肉中表達上調(diào)，可能影響Ca2+轉(zhuǎn)運和氧化代謝途徑[25]；METTL21C能夠調(diào)節(jié)骨骼和肌肉的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，通過NF-κB信號通路促進小鼠成肌細胞分化[8]；中國青年男性METTL21C基因的多態(tài)性與骨密度和脂肪總量相關(guān)，影響骨質(zhì)疏松癥和肥胖[26]。然而，在蛋白質(zhì)層次有關(guān)METTL21C的催化機制和生物學功能的報道較少，僅在小鼠中發(fā)現(xiàn)METTL21C能夠三甲基化修飾p97的Lys-315位點，是骨骼肌中蛋白降解的重要調(diào)制器[9]，三甲基化修飾熱激蛋白(Hspa8)的Lys-561位點，以增強分子伴侶介導的自噬過程[27]。由此可見，METTL21C作為重要的甲基化修飾酶，可能參與多種胞內(nèi)蛋白的甲基化修飾過程，從而調(diào)控機體的多種生命進程。在不同物種中METTL21C參與和調(diào)控的多種生理功能有待未來進一步深入研究。

本研究基于蛋白質(zhì)信息數(shù)據(jù)庫UniprotKB，通過對36個代表物種METTL21C蛋白的生物信息學分析，表明雖然不同物種METTL21C的氨基酸殘基個數(shù)差異較大，N端序列差異較大，但在進化上高度保守，整體一級序列相似度較高，10個motif序列幾乎覆蓋了全長多肽鏈，哺乳類和鳥類METTL21C分別含其特有的motif序列。不同物種METTL21C的空間構(gòu)象絕大部分區(qū)域近乎完全重疊，僅有少部分自由度較高的局部肽段有一定程度的差異。作為蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡中心與多種蛋白相關(guān)，直接或間接參與多種細胞進程，調(diào)控機體的生命活動，為進一步深入研究不同物種METTL21C的生物學功能及其分子機制提供了理論基礎。