赤霞珠葡萄果實酚成熟度與果皮質地特性的關系

梅 源，金小朵，段冰冰，王 新，蘇周晨星，任一曌，劉 旭,2,3*

(1.西北農林科技大學 葡萄酒學院，陜西 楊陵 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程研究中心，陜西 楊陵 712100；3.西北農林科技大學 合陽葡萄試驗示范站，陜西 合陽 715300)

葡萄酒是以葡萄漿果為原料釀造獲得的，果實采收時漿果的成熟度是影響所釀酒質量的重要因素之一。目前，生產上主要利用技術成熟度即測定果汁中糖、酸的含量及其比值來判斷釀酒葡萄的成熟度，從而決定采收期。但是技術成熟度僅考慮了果肉中糖和酸的含量，忽略了果皮和種子中的花色苷、單寧等酚類物質。這些酚類物質既是葡萄植株體內重要的次生代謝物質，可以緩解葡萄遭受紫外線、病菌和干旱等生物和非生物脅迫的危害，具有抗氧化的功能[1,2]，同時又與葡萄酒的色澤、收斂性、香氣等密切相關，是葡萄酒的重要品質因子[3,4]。因此，近年來越來越多的葡萄酒企業在確定果實采收期時，除了測定糖酸的含量外還要綜合考慮果皮中酚類物質的成熟度[5-7]。但是，目前酚成熟度的檢測具有前處理復雜、檢測設備昂貴、檢測時間長等問題，如何實現酚成熟度的快速、高效檢測是一個亟待解決的問題。

紅色釀酒葡萄果實轉色后果皮中花色苷含量逐漸增加，單寧含量不變或略有降低[8]。同時，果皮的質地特性也發生著相應的變化[9]。這些變化主要與果實成熟期間果皮細胞壁組分、細胞結構、組織膨壓的變化[10]以及由果膠酶主導的果皮細胞壁降解等有關[11-13]。葡萄浸漬發酵期間果皮中花色苷和單寧的釋放能力與果皮質地特性密切相關[14,15]。因此，可利用釀酒葡萄果皮的質地特性檢測預測果實酚類物質含量。該方法不需要前處理，測定時間短，并且可以實現大量樣本的連續檢測，從而提高檢測的代表性和可靠性[16]。目前國內外的相關研究主要集中于利用釀酒葡萄果皮質地特性預測果皮中花色苷的可提取率等[17]，而基于果皮質地特性檢測釀酒葡萄果實酚成熟度的研究較少。因此，本試驗以紅色釀酒葡萄赤霞珠為材料，研究了采自不同產區、不同時期的果實其酚成熟度與果皮質地特性之間的關系，旨在研究釀酒葡萄果實酚成熟度與果皮質地特性之間的回歸模型，從而為釀酒葡萄酚成熟度的快速檢測提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試葡萄品種為歐亞種釀酒葡萄赤霞珠(Vitisviniferacv)，2016年和2017年分別在果實成熟期間的E-L35(30%葡萄轉色)、E-L36(成熟中期)和E-L38(商業采收期)3個時期進行采樣，2 a的采樣地均為陜西涇陽、山西夏縣、寧夏銀川和甘肅武威的釀酒葡萄園(表1)，田間生物學重復3次。

表1 葡萄園基本信息Table 1 Basic information of vineyards

主要試劑：三氯化鐵、硫代硫酸鈉、牛血清蛋白、偏亞硫酸鉀、偏重亞硫酸鈉，均購自國藥集團化學試劑公司；兒茶素、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

TA-XTplus型物性分析儀，英國Stable Micro System公司；UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司等。

1.3 方法

1.3.1 果實基本理化指標測定 每個重復隨機采取100粒漿果，測定粒重。然后從中隨機取出20粒，測定縱徑(L)和橫徑(l)，并按如下公式計算果粒體積和表面積[18]。然后人工破碎所有果實，擠出果汁，紗布過濾后測定可溶性固形物含量(°Brix)、還原糖含量、可滴定酸含量和pH值。

體積/mm3=4πabc/3

(1)

表面積/mm2=4π[(ap×bp+ap×cp+bp×cp)/3]1/p

(2)

式中，a=b=l/2；c=L/2；p=1.607 5。

1.3.2 果實酚成熟度指標測定 參考E.Cagnassoetal[19]的試驗方法，略有修改。每個重復隨機選取50粒漿果，勻漿并稱重。將果漿平均分到2個離心管中，在1個離心管中加入20 mL 0.3 mol·L-1(pH1.0)的草酸溶液；另一個離心管中加入20 mL 0.3 mol·L-1(pH3.2)的磷酸溶液，避光浸漬4 h。離心3 min(8 000 r·min-1)后分別移取上清液。采用二氧化硫脫色法測定總花色苷含量(A1.0)和可提取花色苷含量(A3.2)。用pH3.2磷酸溶液浸提后的上清液稀釋100倍后在280 nm下測定吸光值A280。總酚指數(total phenols index，TPI)、細胞成熟指數(cellular maturity index，CMI)和種子成熟指數(seed maturity index，SMI)按如下公式進行計算：

TPI=A280×100

人體感應模塊，全稱為熱釋電紅外的傳感器模塊，它是一種可以檢測人或動物發射的紅外線而輸出電信號的傳感器，只要設置STM32對應的GPIO引腳為輸入模式，當有人靠近過時就會檢測到高電平，達到報警的功能。引腳圖如圖5所示。

(3)

CMI/%=(A1.0-A3.2)/A1.0×100%

(4)

SMI/%= [1- (A3.2×0.04)/(A280×100)]×100%

(5)

式中，A1.0和A3.2分別為漿果中總花色苷和可提取花色苷含量/mg·L-1。

1.3.3 果皮中酚類物質含量測定 每個重復隨機選取20粒漿果，稱重后撕下果皮，蒸餾水沖洗3次。吸水紙吸干后稱重。在玻璃試管中加入20 mL丙酮水溶液(丙酮/水=2∶1，V∶V)，加入果皮樣品。常溫下避光輕微振蕩浸提24 h，布氏漏斗抽濾得到提取液。

提取液總酚含量測定采用Adams-Harbertson方法[20]，提取液總單寧含量分別采用蛋白質沉淀法(adams-harbertson，A-H)[20]和甲基纖維素法(methyl cellulose precipitation，MCP)[21]測定。

1.3.4 果實質地特性測定 每個重復隨機選取30粒大小相近的漿果，測定果粒赤道線處果皮的硬度。表征果皮硬度的參數為：果皮穿刺力(skin break force，Fsk)、穿刺能量(skin break energy，Wsk)、楊氏模量(Young’s modulus，Esk)。每粒漿果測定果皮硬度后，于赤道線處小心撕下約0.25 cm2的果皮測定果皮厚度，測試條件見表2。

表2 質地特性測試條件Table 2 Operative conditions for textural property analysis

1.4 數據統計與分析

采用SPSS(22.0)軟件進行方差分析、多重比較(Duncan分析法，P≤0.05)、Pearson相關性分析、主成分分析(PCA)和多元回歸分析(MLR)(表3)。圖表采用SPSS 22.0和Origin 2018軟件繪制。

表3 用于統計分析的酚成熟度指標和果皮質地特性參數Table 3 Parameters of phenolic maturity and skin textural properties for statistical analysis

2 結果與分析

2.1 赤霞珠葡萄果實基本理化指標的描述性分析

赤霞珠葡萄果實各個基本理化指標數據集的數值都具有較大的變幅(表4)。漿果粒重的變化范圍為0.54～1.56 g，平均值為1.10 g。每20粒葡萄漿果的表面積和體積變幅分別為280～655 cm2、442～1 577 cm3，平均值分別為474 cm2、980 cm3。果實可溶性固形物的變化范圍從10.10 °Brix到27.50 °Brix，而還原糖、可滴定酸以及pH值的變化范圍分別為64～251 g·L-1、4.14～27.31 g·L-1、2.44～4.80。另外，粒重較小的漿果其果粒表面積、體積、可溶性固形物和還原糖含量也較小，而粒重最大的漿果其體積和表面積值也最大，具有最高可溶性固形物的漿果其還原糖含量也最高(數據未列出)。

表4 赤霞珠葡萄樣品基本理化指標(n=72)Table 4 Summary statistics of the basic physicochemical parameters for Cabernet Sauvignon grapes(n=72)

2.2 赤霞珠葡萄果實酚類物質含量和酚成熟度的描述性分析

赤霞珠葡萄果實酚類物質含量和酚成熟度的描述(表5)可見，果皮中總酚含量最大值與最小值相差1 461 g·L-1，平均值與最小值相差654 g·L-1，說明樣本內總酚含量較大差異。樣本中果皮總單寧的含量及其變幅與采用的測定方法有關，MCP法測得的總單寧含量變化范圍大于A-H法，2個指標在樣本集中的極差分別為1 743 g·L-1和1 135 g·L-1。MCP法測得總單寧的含量在所有樣品中的平均值是A-H法測得值的1.2倍，且根據Pearson相關性分析表明二者之間存在極顯著相關性(P<0.001，數據未列出)。樣本中漿果總花色苷和可提取花色苷含量與果實成熟度密切相關，均在轉色初期(E-L35)最低，商業采收期(E-L38)最高。

表5 赤霞珠葡萄果實酚類物質含量及酚成熟度(n=72)Table 5 Summary statistics of the phenolic compounds content and phenolic maturity for Cabernet Sauvignon grapes (n=72)

整個樣本中細胞成熟指數(CMI)變幅較大，為44.26%，說明赤霞珠葡萄果實中花色苷的可提取率與成熟狀況密切相關。種子成熟指數(SMI)變幅也較大，為93.5%，說明赤霞珠葡萄果實種子中單寧含量占果實單寧總量的比例也與果實成熟進程密切相關。果實總酚指數(TPI)用來反映果實中總酚的水平，可見樣本中TPI的變幅相對較小，為29.68，說明赤霞珠葡萄果實成熟期間總酚水平的變化幅度相對較小。

2.3 赤霞珠葡萄果皮質地特性的描述性分析

赤霞珠葡萄果皮質地特性指標包括果皮厚度(Spsk)和表征果皮硬度的3個指標，由表6可見，樣本中果皮厚度的變幅較小，最大值與最小值的差值僅為0.24 mm。而樣本中果皮硬度指標的極差均較大，最大的為果皮穿刺能量(Wsk)，為0.83 mJ。可見赤霞珠葡萄果實成熟期間果皮厚度的變幅較小，而硬度的變化更加明顯。

表6 赤霞珠葡萄樣品質地特性(n=72)Table 6 Summary statistics of skin textural properties for Cabernet Sauvignon grapes (n=72)

2.4 相關性分析

主成分分析各變量的載荷圖(圖1)可見，PC1和PC2 2個主成分的累計方差貢獻率為62.2%。酚類物質含量指標如總酚(TP)、總花色苷(TA)、可提取花色苷(EA)、總單寧含量(Tmcp、Tah)等均位于PC1的正向端，酚成熟度指標CMI也位于PC1正向端，與位于PC1負向端的TPI、SMI和Wsk等指標呈負相關。特別是TP、TA、EA以及總單寧含量(Tmcp)等幾個指標與PC1呈正相關，而SMI與PC2呈負相關。除了Spsk、Wsk和CMI 3個指標位于PC2負向端外，其余所有指標均分布在PC2的正向端，且果皮質地特性參數在4個象限均有分布。另外，果皮厚度(Spsk)在PC1和PC2上的特征向量值均很低，分別為-0.06和0.031，說明果皮厚度和PC1、PC2的相關性均不強，可能是一個單獨的主成分。

為了研究各個指標之間相關關系的顯著性，對所有變量進行了Pearson相關分析，由表7可見，果皮厚度(Spsk)與酚類物質含量和酚成熟度指標間均無顯著相關性，果皮穿刺力(Fsk)與總酚指數(TPI)呈極顯著正相關，而與細胞成熟指數(CMI)呈顯著負相關，說明隨表征果皮硬度的果皮穿刺力的增大，果實細胞成熟指數(CMI)值變小。果皮穿刺能量(Wsk)與總酚含量(TP)、單寧含量(Tmcp)、總花色苷含量(TA)、可提取花色苷含量(EA)和細胞成熟指數(CMI)均呈現顯著或極顯著的負相關，而與種子成熟指數(SMI)和總酚指數(TPI)呈顯著正相關，該結果與圖1中顯示的一致。表征果皮硬度的楊氏模量(Esk)與總單寧含量(Tah)呈極顯著正相關(r=0.348，P<0.001)。相關性分析表明，赤霞珠葡萄表征果皮硬度的參數與酚類物質含量和果實酚成熟度之間存在良好的相關性。

表7 赤霞珠葡萄果皮質地特性與酚類物質含量及酚成熟度的相關性Table 7 Correlation between skin textural properties and phenolic maturity,phenolic compound content of Cabernet Sauvignon grapes

圖1 主成分分析載荷Fig.1 PCA loading plot

2.5 多元回歸分析

采用多元線性回歸分析(MLR)，選擇表征赤霞珠葡萄果皮質地特性的4個指標作為自變量，酚類物質含量和酚成熟度指標作為因變量進行回歸擬合，最終只有3個因變量指標(CMI、SMI、TA)具有較好的擬合效果(表8)。對因變量CMI和TA而言，赤霞珠果皮質地特性相關的4個指標均是有效的自變量，擬合模型的決定系數(R2)分別為0.831和0.759。而4個質地特性指標中僅有Fsk、Wsk和Esk為酚成熟度指標SMI有效的自變量，R2值為0.770，P值均<0.001。3個擬合模型的決定系數分別為0.831、0.770和0.759，表示這3個自變量解釋了相應因變量83.1%、77.0%和75.9%的變異性。進一步分析的預測結果表明(圖2)，預測模型的預測值與實際值具有良好的線性相關性。

圖2 MLR建模下赤霞珠葡萄果實酚成熟度和酚類物質含量預測值與實際值的比較Fig.2 Predicted vs observed values of phenolic maturity and phenolic compound content of Cabernet Sauvignon grapes using MLR modeling

表8 多元回歸分析結果Table 8 Results of the MLR analysis

3 結論與討論

釀酒葡萄果實中的酚類物質種類繁多，含量豐富。總酚含量在一定程度上可以全面、綜合地反映釀酒葡萄原料質量的優劣及其營養價值的高低，花色苷和單寧含量也與釀酒葡萄的質量密切相關[22]。本試驗采用了2種方法測定葡萄果皮中總單寧的含量，其中采用MCP法測定的單寧含量均高于A-H法，這與張振文等[23]在葡萄酒上的研究結果一致。2種測定方法造成的差異可能是由于甲基纖維素和蛋白質與酚類物質結合能力的不同引起的。目前釀酒葡萄果實酚成熟度的測定主要是基于各種酚類物質的提取率，如CMI、SMI[24]和TPI等[19]。葡萄果實中花色苷主要位于漿果表皮下3～4層細胞的液泡里，因此花色苷的提取率與果皮顯微結構、質地特性密切相關。而細胞成熟指數(CMI)是漿果中難以提取部分花色苷與總花色苷含量的比值，以衡量葡萄漿果中花色苷的可提取性。前人研究發現，葡萄果皮越厚，花色苷越不容易被浸提出來，即CMI值越大；表征果皮硬度的Esk越大，花色苷越容易被浸提出來，即CMI值越小，而本試驗的樣本集中2016年和2017年所有葡萄樣品均呈現出與之類似的規律，與前人研究結果一致[25,26]。另外，本試驗中各產區赤霞珠葡萄的細胞成熟指數(CMI)隨著果實的成熟逐漸增加，與E.Cagnassoetal[19]的研究一致。而總酚指數(TPI)和種子成熟指數(SMI)逐漸下降。SMI值在赤霞珠葡萄果實成熟過程中逐漸降低，說明來自于種子的苦味單寧占的比例越低，葡萄的成熟度也越好[27]。

釀酒葡萄果皮質地特性包括果皮厚度和硬度，是表征葡萄果皮物理特性的重要指標。本試驗中Spsk隨著葡萄果實的成熟逐漸增加，Wsk的變化趨勢與果皮厚度相反。而Fsk和Esk的最小值、最大值均為同一時期不同產區的樣品，說明同時期不同產區的Fsk和Esk差異較大。另外，不同產區同一生長期、同一產區不同生長期的赤霞珠葡萄樣品其果皮厚度均存在一定的差異性，但是差異相對較小。F.Torchioetal[28]研究發現,不同小產地間Barbera葡萄果皮厚度無顯著性差異，這可能與該試驗中葡萄園地間的氣候條件差異較小有關，也可能與Barbera葡萄品種的果皮發育特征有關。硬度表征的是固體物質抵抗永久形變的阻力，反映了組織的表面質地特性[29]。表征葡萄果皮硬度的3個參數：Fsk定義為探針穿透果皮所需要的力，Wsk定義為探針穿透果皮所做的功，為穿刺力和穿刺距離的乘積，說明Wsk除了與果皮穿刺力有關外，還與果皮的厚度密切相關；Esk則表征果皮形變的大小，可定義為果皮的剛性，其數值越大說明果皮越不容易發生永久形變，即果皮越硬[30]。因為Esk與果皮細胞的密度有關，不同地區、不同時期釀酒葡萄果皮Esk的差異應就果皮組織化學特性進行進一步研究。

葡萄果皮細胞壁的結構和物理特性很大程度上決定了果皮釋放花色苷的能力[31]。因此，與葡萄果皮細胞壁組成、結構和組織膨壓等相關的質地分析可以用來評估果皮中花色苷的提取率，從而間接評估果實中花色苷的含量[10,32]。S.S.Ríoetal[33]也發現葡萄成熟期間果皮中花色苷的提取率和果皮穿刺力、果皮厚度間呈現良好的相關性。本試驗的相關性分析中發現，Fsk與CMI呈負相關，這與S.R.Segadeetal[18]在Mencía葡萄上的研究結果一致，說明果皮越硬，花色苷越不容易被提取出來。而果皮中花色苷可提取能力的差異，可能與果皮細胞壁中的多糖(半乳糖和阿拉伯糖)、纖維素含量以及果膠甲基化程度有關[12]。本試驗中楊氏模量(Esk)與A-H法測得的總單寧含量呈極顯著正相關(r=0.348，P<0.01)，Wsk與MCP法測定單寧含量之間呈負相關(r=-0.511，P<0.01)，說明果皮硬度可以作為預測果皮單寧含量的指標。E.I.Garcíaetal[34]發現，利用漿果硬度可以預測丹魄葡萄果皮黃烷醇的含量。由此可見，果皮質地特性也可以用于預測釀酒葡萄果皮中酚類物質的含量。

本試驗的MLR分析表明，表征赤霞珠果皮厚度的參數Spsk和表征果皮硬度的3個參數Fsk、Wsk、Esk與CMI、SMI和TA等酚成熟度指標之間存在顯著的線性回歸關系，說明4個質地參數可用于預測釀酒葡萄赤霞珠果實的酚成熟度。但是，為了提高預測準確性，應進一步針對不同的葡萄品種、不同產區建立相應的回歸關系，并篩選更廣泛的果皮質地參數。綜上，本試驗研究了釀酒葡萄果皮質地特性和酚成熟度的相關性，建立了酚成熟度與質地特性之間的回歸模型，其中預測效果最好的指標是細胞成熟指數CMI(R2=0.831)、種子成熟指數SMI(R2=0.770)和總花色苷含量TA(R2=0.75)，試驗結果為釀酒葡萄果實酚成熟度快速檢測方法的建立提供了一定的理論和技術基礎。