中國食管癌高發區無癥狀人群液體活檢技術篩查早期食管癌和高危人群的多中心應用研究

孟超龍，趙學科，崔曉賓，程 錕，胡守佳，王盼盼，鐘 侃，胡景峰，宋 昕，王 偉，李欣然，楊苗苗，徐瑞華，魏夢霞，韓文莉，雷玲玲，姚品芳，熊 飛，伊力亞爾·夏合丁，李 鋒，曹維克，王立東

(1.鄭州大學第一附屬醫院河南省食管癌重點開放實驗室、省部共建食管癌防治國家重點實驗室，河南 鄭州450052；2. 新疆石河子大學基礎醫學院病理學教研室，新疆 石河子 832003；3. 湖北省腫瘤醫院研究所，湖北 武漢 430079；4. 湖北省腫瘤醫院胸外科，湖北 武漢 430079；5. 新疆醫科大學第一附屬醫院胸外科，新疆 烏魯木齊 830054；6. 淮安市第一人民醫院檢驗科，江蘇 淮安 223300)

湖北鐘祥、新疆烏魯木齊、江蘇南京是食管癌發病率和死亡率較高的3個地區。目前，食管癌依然是3個地區腫瘤相關主要死亡原因。早期食管癌患者癥狀并不典型,隨著病情的發展可逐漸出現吞咽困難、食管內異物感及胸骨后燒灼樣疼痛等癥狀[1]，首次就診的患者90%左右已經處于中晚期[2-3]。本課題組以往研究[4]表明：使用液體活檢技術從無癥狀人群中確定高危人群，再進行色素內鏡檢查是目前實現食管癌早期發現的最佳技術。多種腫瘤相關抗原可以在食管癌組織中表達，并且可以在食管癌患者血液中檢測到相應的自身抗體，不同的抗體表達的量有所不同[5]。本研究團隊使用液體活檢技術檢測食管癌高發區無癥狀人群血清中腫瘤相關抗原自身抗體，然后根據液體活檢技術檢測結果，進一步做色素內鏡檢查，探索自身抗體聯合檢測在食管癌早期發現和高危人群篩查中的意義，并建立相應的能用于大規模食管癌高危人群篩查的液體活檢技術。

1 資料與方法

1.1 研究對象第1組人群來自鄭州大學第一附屬醫院河南省食管癌重點開放實驗室血清樣本，其中正常人血清245例作為對照組，早期食管癌患者血清245例作為早期食管癌組。245例正常人血清來自該實驗室合作醫院體檢中心的健康體檢人群，無任何腫瘤相關的證據。245例正常人中，男121例、女124例，年齡35～70(52.07±10.21)歲。245例早期食管癌患者血清來源于經組織病理學證實的早期(0期+Ⅰ期)食管癌患者，均未接受放療或化療治療。245例食管癌患者中，男135例、女110例，年齡35～70(59.45±6.99)歲。

第2組人群來自于豫北食管癌高發區某鎮流行病學調查，共納入自愿接受流行病學調查、液體活檢和色素內鏡檢查的無癥狀人群1 755例，男869例、女886例，年齡35～70(51.91±10.33)歲。

第3組人群來自于湖北鐘祥、新疆烏魯木齊、江蘇南京食管癌大規模篩查，共納入自愿配合食管癌篩查的無癥狀人群6 325例，其中男3 132例、女3 193例，年齡35～70(51.96±10.30)歲。對其進行液體活檢，5種血清腫瘤相關抗原自身抗體有至少1種陽性者再進行色素內鏡檢查。

1.2 方法

1.2.1 檢查試劑和方法 對3組研究對象分別抽血，每例均取空腹靜脈血5 mL至離心管中，室溫靜置30 min，然后離心(2 000 r/min)20 min，吸取上層血清進行分裝，每管100 μL，用液氮進行保存，最后儲存到-80 ℃冰箱內備用。

提取和純化的乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)、B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白(B cell lymphoma/leukemia-2 associated X protein，BAX)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance associated protein，MRP)來自美國Scripps研究所。

采用本研究團隊以往建立的間接酶聯免疫吸附試驗方法對所取標本進行上述5種血清腫瘤相關抗原自身抗體檢測[6-7]，各包被抗原的稀釋終濃度為0.5 μg/μL，血樣稀釋濃度為150，稀釋濃度為15 000的抗人IgG用辣根過氧化物酶標記。在酶聯免疫吸附試驗板孔中加入用包被稀釋液稀釋過的抗原100 μL/孔，4 ℃過夜(24 h以上)。加入稀釋后的患者血清100 μL/孔,每個樣品至少要做2次檢查，在37 ℃條件下孵育。已知陽性血清為陽性對照，包被緩沖液為陰性對照。加入稀釋后的辣根過氧化物酶標記的抗人IgG 100 mL/孔, 在37 ℃條件下孵育。加入四甲基聯苯胺-過氧化氫尿素顯色液，100 μL/孔，置于37 ℃條件下避光反應，當陽性對照出現比較明顯的顏色變化后, 每孔加入終止液50 μL終止反應，最后在酶聯免疫吸附試驗讀數儀上讀取450 nm波長處光密度值。

1.2.2 血清學結果判定 采用美國Scripps研究所制定的判定方法確定截斷值，讀數在此截斷值以上的為陽性，否則為陰性[3,8]。

1.2.3 色素內鏡檢查 對液體活檢技術檢測5種血清腫瘤相關抗原自身抗體有至少1種陽性者和大致相應數量陰性者進行色素內鏡檢查，用常規方法在食管中取活檢組織，并在肉眼可見的病變處隨機取活檢組織，必要時進行染色，在食管不染區和賁門染區取材，所有的活檢組織全部快速置于體積分數85%乙醇內固定[9-11]。

1.2.4 病理組織學檢查 對色素內鏡下夾取的食管活檢組織，采用體積分數85%乙醇固定，常規脫水后用石蠟包埋，每張切片的厚度為5 μm，進行HE染色，然后進行組織病理學診斷。

1.3 統計學處理采用SPSS 22.0進行統計學分析，計數資料用百分數表示，比較用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 早期食管癌組和對照組研究對象血清腫瘤相關抗原自身抗體表達比較早期食管癌組BCRP、hTERT、BAX、VEGF和MRP等5種血清腫瘤相關抗原自身抗體陽性率均高于對照組，差異均有統計學意義(χ2=6.053，P<0.001；χ2=5.833，P<0.001；χ2=4.200，P<0.001；χ2=4.374，P<0.001；χ2=4.992，P<0.001)。隨著自身抗體組合數目的增加，早期食管癌診斷的敏感性也隨之增加，5種腫瘤相關抗原自身抗體聯合檢測的敏感性高達86.94%；雖然隨著抗體數目的增加，特異性逐漸降低，但5種腫瘤相關抗原自身抗體聯合檢測的特異性仍然能夠達到82.45%。結果提示，5種腫瘤相關抗原自身抗體聯合檢測既能保持較高的特異性，又能提高診斷的敏感性。見表1、2。

表1 早期食管癌組和對照組研究對象血清腫瘤相關抗原自身抗體表達比較 n(%)

表2 不同腫瘤相關抗原自身抗體聯合檢測對食管癌的診斷效能 n(%)

2.2 小規模人群驗證在豫北食管癌高發區某鎮進行流行病學調查，納入自愿配合食管癌篩查的無癥狀人群1 755例，利用食管癌高危人群預警和早期發現的關鍵技術對其進行液體活檢，并與色素內鏡檢查結果進行比較。1 755例無癥狀人群年齡、性別分布見表3，液體活檢與色素內鏡檢查比較結果見表4。

表3 1 755例無癥狀人群年齡、性別分布 n(%)

表4 液體活檢與色素內鏡檢查結果比較 n(%)

2.3 大規模人群驗證結果在湖北鐘祥、新疆烏魯木齊、江蘇南京進行流行病學調查，納入自愿配合食管癌篩查的無癥狀人群6 325例，年齡、性別分布見表5。利用食管癌高危人群預警和早期發現的關鍵技術對其進行液體活檢，結果發現陽性(高危)人群1 018例，陰性(正常)人群5 307例。1 018例液體活檢陽性人群進行色素內鏡檢查，結果發現正常567例(8.96%)、癌前病變286例(4.52%)、食管癌[149例(2.36%)，其中早期食管癌130例(2.06%)、晚期食管癌19例(0.30%)]、其他上消化道腫瘤16例(0.25%)。

表5 6 325例無癥狀人群年齡、性別分布 n(%)

3 討論

食管癌的發生、發展是一個多步驟、多階段、復雜的演進過程[12]，但其明確的發病因素及分子機制仍然不是十分清楚[6]。同時，高發區食管癌的發病率和死亡率仍然比較高，患者就診時間相對過晚使治療效果并不理想，因此，食管癌的早發現、早診斷和早治療非常關鍵。本研究分別對BCRP、hTERT、BAX、VEGF和MRP等5種血清腫瘤相關抗原自身抗體進行檢測，并對其進行最優組合，結果提示，BCRP、hTERT、BAX、VEGF和MRP的組合可用于早期食管癌診斷和高危人群篩查。

本研究團隊在湖北鐘祥、新疆烏魯木齊、江蘇南京開展了多中心應用性研究，用血清腫瘤相關抗原自身抗體聯合檢測食管癌高發區無癥狀人群，篩查出至少1種自身抗體陽性人群，然后做色素內鏡檢查，結果表明，本實驗室團隊建立的食管癌高危人群預警和早期發現的關鍵技術應用后可區分早期食管癌和癌前病變。因此，在食管癌高發區應用自身抗體聯合檢測液體活檢技術對篩查早期食管癌和高危人群有一定實用價值。

與傳統色素內鏡篩查技術相比，本實驗室團隊建立的食管癌高危人群預警和早期發現的關鍵技術不僅實現了上消化道惡性腫瘤的精準篩查,更明確了癌前病變惡性轉歸人群監測范圍。明顯減輕財政負擔和患者的精神壓力，且該液體活檢技術具有成本低、無創和精準等特點，值得推廣應用。