多發性骨髓瘤患者血清中LncRNA PRAL 的表達及與臨床病理參數和預后的關系

張李玉 顧喆贇 周曉丹 王 鈴 陶 健

南通大學第二附屬醫院血液科，江蘇南通 226001

多發性骨髓瘤（MM）是骨髓漿細胞發生過度克隆增殖性疾病，每年MM 發病例數達12 萬人，占血液系統惡性腫瘤的12%，近年來其發病率有逐漸增加的趨勢[1-2]。深入研究MM 的疾病發生發展的分子機制，對于尋找新的診斷及治療靶點，具有重要的臨床價值[3]。長鏈非編碼RNA（LncRNA）PRAL 基因位于17p13.1，是一種調控抑癌基因P53 相關LncRNA，參與正常細胞的發育分化、細胞增殖凋亡等過程的調控[4]。研究表明，LncRNA PRAL 在非小細胞肺癌[4]、肝癌[5]等腫瘤中均存在異常表達降低的現象，進而抑制下游靶基因P53 的表達，促進腫瘤的發生發展。有研究發現[6]，在MM 原代細胞及MM 細胞系中存在LncRNA PRAL 表達降低的現象，是MM 重要的診斷治療的分子靶點。目前MM 患者血清中LncRNA PRAL 的表達水平及臨床意義報道較少。本研究通過檢測MM 患者血清中LncRNA PRAL 表達水平，分析其表達與臨床病理特征及預后的關系，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年1 月—2017 年1 月南通大學第二附屬醫院（以下簡稱“我院”）診治的82 例MM 患者臨床資料作為病例組。納入標準：①MM 診斷符合2003 年國際骨髓瘤工作組（IMWG）MM 診斷標準[7]。②臨床病理和隨訪資料均完整。③患者及其家屬對本研究知情同意并簽署同意書。排除標準：①合并惡性腫瘤病史或治療史。②合并白血病、淋巴瘤等其他血液系統疾病。③合并肺炎、結核等感染性疾病。④神經精神障礙，不能配合治療或隨訪者。⑤以往接受過其他治療。男46 例，女36 例；年齡37～73 歲，平均（58.4±6.7）歲；按照國際分期系統（ISS）[8]進行分期，其中Ⅰ期（β2-MG≤3.5 mgL，白蛋白＞35 g/L）14 例，Ⅱ期（3.5 mgL<β2-MG＜5.5 mg/L）32 例，Ⅲ期（β2-MG≥5.5 mg/L）36 例；D-S 分期：Ⅰ期13 例，Ⅱ期18 例，Ⅲ期51 例；診斷分型：IgG 型34 例，IgA 型27 例，輕鏈型及其他型21 例；血紅蛋白＜100 g/L 53 例，≥100 g/L 29 例；血鈣＜2.98 mmol/L 61 例，≥2.98 mmol/L 21 例；乳酸脫氫酶＜245 U/L 60 例，≥245 U/L 22 例。以血清LncRNA PRAL 表達的平均值2.125 為界，分為高LncRNA PRAL表達組40 例和低LncRNA PRAL 表達組42 例。以我院同期診治的50 例罹患其他血液疾病患者作為病例對照組，男28 例，女22 例；年齡40～73 歲，平均（57.5±6.4）歲；非霍奇金淋巴瘤16 例，急性淋巴細胞白血病17 例，慢性粒細胞白血病17 例。診斷均符合2007 年《血液病診斷和療效標準》[9]。51 名我院同期健康體檢的健康人群作為健康對照組，其中男27 名，女24 名；年齡39～72 歲，平均（56.6±6.5）歲。三組性別、年齡比較，差異無統計學意義（均P ＞0.05），具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準通過。

1.2 治療療效評價及隨訪

82 例MM 患者均接受以硼替唑米為基礎的聯合化療方案誘導治療，硼替唑米用藥劑量為1.3 mg/m2，共4 個療程。化療方案包括BAD 方案（硼替佐米+多柔比星+地塞米松）、BADT 方案（硼替佐米+多柔比星+地塞米松+沙利度胺），維持治療方案為沙利度胺，劑量50 mg/d，2 次/周，維持2 年。療效評價標準采用歐洲血液及骨髓移植協作組制訂的歐洲骨髓移植協作組（EBMT）標準[10]，主要分為完全緩解、部分緩解、病情穩定、疾病進展。

隨訪：自患者出院之日起開始隨訪，隨訪截止至2020 年1 月，以門診或電話方式進行隨訪，1 次/月，隨訪內容為患者生存情況，隨訪終止時間為患者發生死亡事件或隨訪時間結束。

1.3 熒光實時定量PCR（qRT-PCR）檢測各組血清中LncRNA PRAL 表達

取各組清晨空腹靜脈血約5 mL，EDTA 抗凝，4℃1200 r/min，離心10 min，離心半徑10 cm，將上層血清-80℃保存待測。取200 μL 樣品，Trizol 法提取血清中總RNA，Narodrop 鑒定RNA 的濃度及純度。以1 μg RNA 為模板進行反轉錄，合成cDNA。應用SYBR Premiers Ex Taq Kit（TaKaRa 公司）試劑盒（生產批號：DRR041）在ABI PRISM 7900 qRT-PCR 儀上（ABI 公司，美國）進行反應。反應體系為5×primerScript Buffer 2 2 μL，PrimerScript RT Enzyme MixⅠ1 μL，模板10 μL，頸環引物1 μL，加入DEPC 水補足至20 μL體系。總反應體系：2×Master Mix 10 μL，上游及下游引物分別1 μL，cDNA 1μl，無RNA 酶水7 μL。反應條件為：95℃2 min，95℃20 s，60℃20 s，70℃20 s，39 個循 環。LncRNA PRAL 正 向 引 物 序 列：5′-GGCA GAGTCT-CGCTTGGT-3′，反向引物序列：5′-GAAACTCCGTCTCCGCTAA-3′；內參基因GAPDH 正向引物序列：5′-CGGATTTGG-TCGTATTGGG-3′，反向引物序列：5′-CTGGAAGAT-GGTGATGGGATT-3′。結果采用2-ΔΔCt值方法進行數據分析，其中ΔCt=CtLncRNAPRAL-CtGAPDH。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計學軟件對所得數據進行分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗，計數資料采用例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，等級資料采用秩和檢驗。Kaplan-Meier 生存分析病例組不同LncRNA PRAL 表達患者生存預后的差異。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清中LncRNA PRAL 表達比較

病例組、病例對照組和健康對照組血清中LncRNA PRAL 的相對表達量分別為（2.125±0.127）、（4.065±0.153）、（4.117±0.161），病例組患者血清中LncRNA PRAL的相對表達量明顯低于病例對照組及健康對照組（t=79.005、80.045，P=0.000、0.000），而病例對照組與健康對照組比較，差異無統計學意義（t=1.663，P=0.099）。

2.2 MM 病例組血清中LncRNA PRAL 表達與臨床病理特征的關系

MM 病例組不同ISS 分期患者血清中LncRNA PRAL 的相對表達量比較，差異有統計學意義（P ＜0.05），而患者不同年齡、性別、D-S 分期、診斷分型、血乳酸脫氫酶、血鈣及血紅蛋白水平血清中LncRNA PRAL的相對表達量比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表1。

2.3 不同LncRNA PRAL 表達患者的治療效果比較

MM 病例組LncRNA PRAL 高表達組的效果優于LncRNA PRAL 低表達組（P ＜0.05）。見表2。

2.4 不同LncRNA PRAL 表達患者預后差異

本研究中，82 例MM 病例組隨訪時間4～36 個月，平均（35.1±5.7）個月，隨訪期間無失訪病例。截止至隨訪時間結束時，死亡患者例數為31 例，高LncRNA PRAL表達組及低表達組的3 年總體生存率分別為75.0%（30/40）、50.0%（21/42），平均生存時間分別為（33.1±6.2）、（29.6±5.9）個月。Kaplan-Meier 生存分析結果提示，血清LncRNA PRAL 低表達組的3 年OS 明顯低于高表達組（χ2=5.143，P=0.014），LncRNA PRAL低表達組平均生存時間明顯短于高表達組（t=2.619，P=0.011）。見圖1。

表1 MM 病例組血清中LncRNA PRAL 表達與臨床病理特征的關系（）

表1 MM 病例組血清中LncRNA PRAL 表達與臨床病理特征的關系（）

注：MM：多發性骨髓瘤；IgG：免疫球蛋白G；IgA：免疫球蛋白A；ISS分期：多發骨髓瘤國際分期系統；D-S 分期：Durie-Salmon 分期

表2 不同LncRNA PRAL 表達患者的治療療效比較（例）

圖1 不同LncRNA PRAL 表達患者3 年總體生存率差異

3 討論

MM 是分泌產生M 蛋白的漿細胞惡性增殖性疾病，MM 細胞過度增殖，導致患者出現廣泛的骨質病變、腎功能損傷、貧血、高鈣血癥等臨床表現，嚴重威脅人類健康[11]。目前MM 的治療包括化療、免疫調節因子、蛋白酶體抑制劑及自體造血干細胞移植等，雖然延長患者生存時間，但均無法徹底根治。有研究報道，常規VAD 或MP 的聯合化療方案治療MM 患者的完全緩解率不足10%[12]。分子生物學研究發現，MM 的發病是一個逐漸變化的過程，非編碼RNA 在MM 的疾病發生發展過程中發揮重要的生物學調控功能，能夠影響漿細胞的分化發育、增殖、凋亡及轉移等生物學過程，是MM 疾病進展的重要調控分子[13]。

近年來研究表明[14-16]，LncRNA 參與基因的轉錄、蛋白質翻譯、干細胞功能調控及熱休克等病理生理過程，與炎癥、免疫及腫瘤等疾病關系密切。研究發現，LncRNA PRAL 基因的異常表達參與調控P53 介導的腫瘤細胞的增殖和凋亡，并且與肝細胞肝癌患者預后不良有關[17]。研究發現，LncRNA PRAL 與MM 患者的預后及化療耐藥性有關，可能成為MM 新的診斷治療靶點[18]。本研究中，MM 病例組血清中LncRNA PRAL表達較低，其機制可能與MM 發生時LncRNA PRAL的編碼基因缺失型突變有關。研究[19]表明，腫瘤發生時，LncRNA PRAL 的基因位點是17p13.1，而17 號染色體長臂的缺失型突變17（del）較為常見，導致LncRNA PRAL 基因轉錄及翻譯水平顯著降低。此外，本研究中ISS 分期越高，MM 患者血清中LncRNA PRAL表達水平越高。其機制可能是，LncRNA PRAL 表達缺失能夠抑制P53 蛋白由細胞質進入細胞核，抑制P53的功能，導致MM 惡性增殖，凋亡減少，MM 細胞分泌大量β2-MG，導致ISS 分期升高。體外細胞實驗亦表明，腫瘤細胞中過表達LncRNA PRAL 能夠促進P53蛋白的表達，并顯著抑制腫瘤細胞的增殖[20]。本研究中，病例組LncRNA PRAL 高表達組療效優于LncRNA PRAL 低表達組。研究報道，LncRNA PRAL 表達降低時，其結合并抑制miR-210 的能力降低，抑制骨形態發生蛋白2（BMP2）的表達，導致硼替佐米促進成骨細胞產生BMP2 的能力下降，抑制多能造血干細胞向成骨細胞分化，加重骨質破壞[21-22]。有學者報道，LncRNA的表達水平與肺癌、肝癌及卵巢癌等腫瘤患者的生存預后關系密切[23-25]。本研究中，血清LncRNA PRAL 低表達組3 年OS 明顯低于高表達組，平均生存時間亦明顯較短，提示血清LncRNA PRAL水平有可能成為判斷MM 患者生存預后的血清標志物。

綜上所述，MM 患者血清中LncRNA PRAL 表達降低，血清中LncRNA PRAL 表達與ISS 分期有關，血清低表達LncRNA PRAL 的MM 患者以硼替佐米為初始治療的化療的完全緩解率較低。血清低表達LncRNA PRAL 的MM 患者的生存預后較差。因此，LncRNA PRAL 參與MM 的發生發展過程，有可能成為評估MM 預后的重要指標。