生物樣品中多肽定量分析方法

韓寧娟，方歡樂，劉建利

（1.西安培華學院醫學院，陜西西安 710125；2.西北大學生命科學院，陜西西安 710065）

肽類藥物在自然界中廣泛存在，一般都含有3～50個主要氨基酸。其中，氨基酸殘基數小于15的被稱為小分子肽。這些肽在各種生物系統中起著重要作用，參與細胞分化、神經遞質調節和腫瘤疾病的發生[1]。肽類藥物在體內的代謝非常復雜，生物體中還存在著內源性的物質干擾，同時這類藥品的用劑量較小，體液中藥物濃度很低，這就要求檢測方法有較高的靈敏度和特異性。目前，生物樣品中肽類藥物檢測的方法主要有生物檢查法、免疫檢驗法、同位素標志示蹤法以及色譜等。本文從生物樣品處理、定量分析方法的特點兩方面綜合論述近年來的研究成果。

1 生物樣品的預處理方法

常見生物樣本有血漿、血清、尿液、唾液及組織等。小分子肽的理化性質介于小分子化藥與大分子蛋白質之間，生物樣品中經常含有與小分子肽結構相似的其他多肽類物質（內源性物質），進行色譜分析時會堵塞色譜柱，或干擾目標物的分析。因此，分析時需對樣品進行預處理，減少對系統的污染，提高分析結果的準確度和精密度，同時可延長色譜柱壽命，改善色譜組分行為。目前，國內外對生物樣品預處理的方法主要有蛋白沉淀法、液液萃取法和固相提取等。

1.1 蛋白沉淀法

蛋白沉淀法是利用鹽析方法通過降低蛋白質的溶解度，使蛋白質凝聚從溶液中沉淀析出的一種方法。通過沉淀蛋白，不僅可以釋放結合到血漿蛋白中的藥物，從而達到提純待測組分的目的，也可測定藥物的總濃度，還能夠預防提取過程中蛋白質發泡引起的乳化，保護分析儀器，延長使用壽命。常用的沉淀蛋白質的溶劑有甲醇、乙腈、三氯乙酸等。一般進行蛋白沉淀有機溶劑的體積是樣品體積的數倍（最少2～3倍），經過高速離心后吸取上清液直接進樣分析或稀釋后進樣分析。

1.2 液液萃取法

液液萃取是一種經典的萃取方法，利用目標物在溶劑中溶解度或分配系數上的差異達到分離提取目標物的目的。在選用萃取溶劑時，利用相似相溶原則，對于非極性組分的樣品，可以以水為基質，用與水互不相容的有機溶劑進行提取，防止帶入水溶性雜質，且需滿足無毒、沸點低、易揮發和濃縮的條件。另外，液液萃取容易發生乳化現象。該方法優點是回收率高、成本低，易去除無機鹽和磷脂，基質效應較小；缺點是比較費時費力、有機溶劑消耗量大，對環境污染大，不容易實現自動化以及容易丟失被測組分等。

1.3 固相萃取法

固相萃取法是基于被測組分在流動相與固定相之間分配系數不同而實現的。將被測組分吸附在固定相上，再選擇適當的溶劑沖去雜質，再用被測物質溶解度好的溶劑進行沖洗。操作時，可選用在負壓、正壓和常壓下完成。負壓下是有機溶劑揮發較易，有時待測物質會丟失；正壓能縮短樣品的處理時間，但若加的壓力太大會導致溶劑流速變快，使分離效率降低；常壓操作費時，使用較少。固相萃取的優點是回收率高、選擇性好、效率高，但耗材費用高，也容易堵塞萃取柱。

2 分析方法

目前，檢測生物樣本中的小分子肽有生物檢定法、酶聯免疫檢查法、放射免疫分析、電化學光譜和液質聯用等分析方法。液質聯用色譜法是多肽分析的常用方法之一；其余方法都是基于抗體分析/抗原特定性識別，對目標多肽進行定量分析，屬于結合配體分析方法，是多肽藥物分析的最常用方法。

2.1 配體結合分析法

配體結合分析法是檢測多肽的一種常用方法，是基于抗體分析/抗原特定性識別的一種定量分析目標多肽的方法，主要包括酶聯免疫檢測法、放射免疫分析、電化學發光法等。

2.1.1 酶聯免疫檢測法

酶聯免疫檢測法是將被試藥物視為抗原，與標記的抗體形成一種抗原-抗體復合物，最后加入酶標底物。藥物抗原需要抗體才能識別，其方法有一定的特異性。該方法具有操作簡單、快速、靈敏度高、無放射性危害等優點，但不能區分藥物活性和無活性形式，原型藥物及其代謝物。LINDSTR等[2]用ELISA法檢測人血漿中緩激肽，檢測范圍為0.1～1 000 nmol/L。

2.1.2 放射免疫分析法

放射免疫分析法是一種用同位素檢測的高敏度免疫抗原-抗體相結合的特殊反應。Erb等[3]通過電化學發光免疫檢測法確定血清素水平，并通過放射免疫檢測法確定血漿中西曲瑞克的濃度。周杏琴等[4]建立了放射免疫分析法檢測人血漿中特立帕肽，檢測濃度范圍10～1 280 pg/mL。

2.1.3 電化學發光

電化學發光是化學發光方法和電化學方法相結合，通過電化學方法產生一些特殊的物質，電生物質之間或電生物質與其他物質之間進一步反應而產生的一種發光現象，該方法具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器簡單等優點。

陳超等人[5]建立了一種定量測定人血清中胰島素的化學發光免疫方法，并進行了方法學評價，結果表明該方法的線性范圍在0～300 μIU/mL，最低檢測限可達0.08 μIU/mL。

2.2 色譜法

2.2.1 熒光試劑衍生化測定法

熒光分析法是利用物質發射熒光的特性，對物質進行分析的光學分析法，比紫外檢測器的靈敏度高。若多肽類藥物在紫外檢測器下靈敏度低，無法進行體內分析，可與熒光試劑衍生化后，進行熒光檢測。

徐鵬遙等[6]用4-(N-馬來酰亞胺)苯基三甲基碘化銨作為衍生化試劑，對血漿樣品進行衍生化處理后，采用高效液相色譜法-質譜法測大鼠血漿中谷胱甘肽的含量，并進行了方法學驗證，衍生后谷胱甘肽定量下限為10 pmol/L。

2.2.2 液質聯用分析（LC-MS）

液質聯用由液相色譜與質譜兩部分組成，采用色譜分離物質，再由質譜將化合物形成的離子和碎片離子，按荷質比進行分離檢測。該方法能夠探測到化合物分子量和結構的相關信息，用于定性和定量分析，但多肽類藥物易吸附于容器壁、吸管端及LC-MS系統中，導致樣品損失，使得儀器靈敏度降低。因此，在采用液質聯用時要注意容器的材料、肽類結構，還要注意溶液的濃度、pH、溫度和離子強度等。

Everaert等[7]建立了LC-MS法檢測人血漿和尿液中痕量鵝肌肽，并進行了方法學驗證，在人血漿中檢測濃度范圍為5～500 μmol/L，人尿液中鵝肌肽的濃度為 0.5～100 μmol/L。

2.3 其他方法

二維凝膠電泳-質譜法、高效毛細管電泳-質譜聯用、同位素標記技術等也逐步運用在生物樣品中多肽類藥物分析中。

3 結語

在多肽藥物生物樣品的分析過程中，對于抗體試劑容易獲得的多肽類藥物，配體-抗體檢測法是生物樣品的首選方法；對于不易得到的抗體試劑，液質聯用法可以滿足定量分析。鑒于多肽類藥物的特殊性，需要綜合運用生物學、免疫學及理化分析等方法才能得到比較可靠的結果，更加準確、簡便的在線儀器聯用技術將成為今后的主要發展方向。