密閉環境中空氣微生物檢測和監測技術分析

許麗紅

（1.廣東省科學院微生物研究所 廣東省微生物分析檢測中心，廣東廣州 510070；2.華南應用微生物國家重點實驗室，廣東廣州 510070）

密閉環境狀態下，人們的活動以及工作過程中機械、電子設備的操作施工會導致出現高溫、高濕的情況，普遍溫度達到45 ℃以上，濕度接近飽和。這種環境能夠提高微生物的繁殖速度，尤其是部分病毒微生物。長時間不進行空氣流通，會使密閉環境中充滿受污染的空氣。長時間處在這種空氣環境下會對人體造成一定傷害。

1 密閉環境中空氣微生物的主要來源

現階段，關于密閉環境中空氣微生物種類的相關研究較多，但缺乏對于微生物來源的研究[1]。自然環境中的空氣微生物主要有細菌及真菌，分布濃度主要與環境清潔頻率、建筑物植被密度等相關。而密閉環境中的細菌濃度又與自然環境中的細菌濃度呈正相關[2]。另一方面，人為因素是密閉環境中空氣微生物的主要來源。人類在進出密閉環境時，自身服裝、所攜帶的作業設備以及器具等都會附著一些直徑小于100 μm的懸浮顆粒物，其中大于10 μm的顆粒物會降落在地面上，而小于10 μm的顆粒物會飄浮在空中，這些懸浮物會攜帶一定的空氣微生物。且在密閉環境中，人體本身就是一個污染源，其新陳代謝所產生的皮屑、口腔分泌物、毛發等大多帶有致病微生物，夾雜在空氣中形成空氣微生物。人類患病咳嗽時會產生75 000個左右的顆粒物，其康復后咳嗽時的顆粒物為50 000個左右，這些顆粒物也是空氣微生物的來源之一。其他人體活動也會成為空氣微生物的二次來源，如人體排泄時，排泄物中一半以上的固體都夾雜著細菌，在進行沖廁時，這些細菌會霧化漂浮在空氣中，每次大約會產生15萬個氣溶膠顆粒，絕大多數的顆粒小于5 μm，并能夠在密閉環境中持續停留。

2 密閉環境空氣微生物檢測和監測技術探討

2.1 生物芯片技術

生物芯片技術是在微電子加工技術的支持下，在微生物表面構建微生物分析系統，針對蛋白質、細胞等進行準確、高通量化研究，從而達到檢測密閉環境中空氣微生物的目的。生物芯片中匯集著大量的分子原件，能夠在一定時間內進行多方位生物分子檢測，其檢測效率遠超于傳統檢測技術，被科學家稱為20世紀繼大規模集成電路之后的又一次技術改革。生物芯片的應用在基因組學、蛋白質組學方面都有著極高的研究價值，實現了空氣微生物檢測和監測工作的多參數同步測定，完全符合密閉環境的特殊場景要求。此外，生物芯片技術還具備多種空氣微生物同時監測的功能，可以分析微生物的存在狀態，據此采取相應的滅菌手段，從而控制密閉環境中的空氣微生物數量。例如，SPR芯片檢測技術是利用化學還原法將樣本玻璃片制備成納米金單膜層，其對設備的要求較低，且能夠批量進行樣本制備，有效控制檢測成本。實際工作中，設計合成特異的bis-PNA探針，并借助硫醇化合物表面單分子自組裝技術使探針牢固，可以提高SPR生物芯片的敏感性和空氣微生物檢測效果。同傳感器單一檢測方法相比，這種新型生物芯片檢測系統更具備實用性，且造價低廉，可在密閉環境中空氣微生物檢測和監測工作中發揮極大的作用[3]。

2.2 生物衍生技術

生物衍生技術是一種新型空氣微生物檢測技術，主要應用于環境監測、工業生產等方面，其主要優點在于檢測工序簡單、檢測時間短、不會對樣本造成二次污染等。特別是對于密閉環境中的空氣微生物進行活細胞檢測，能夠實現整個細胞系統的外源物質回應，從而滿足微生物種類及密度的高效化測定。將測定結果同標準密度進行比對可以判斷是否需要進行消毒作業。從原理來說，生物衍生技術的核心在于分析生物器件，通過對生物及生物衍生出來的敏感元件進行轉化，得到與微生物相關的數字化電子信號，根據信號強度對樣本進行判斷。目前，生物衍生技術應用實驗中常見的敏感元件主要由生物自身成分構成，其與樣本環境中的微生物濃度有很大關系。與傳統空氣微生物檢測技術手段相比，生物衍生技術的催化劑為固定化生物物質，雖然反應試劑的造價高昂，但可以多次重復使用，且自身工序簡單、檢測時間較短，能夠及時得到檢測結果。但其自身也存在著空氣微生物檢測種類及數量限制、檢測功能較為單一、不能實現密閉環境的長期監測[4]等缺陷。

2.3 落菌檢測技術

落菌檢測技術也被稱為自然沉降法，主要是將適合空氣微生物生長的營養瓊脂培養基經過消毒滅菌環節后，倒入無菌平皿中制作成落菌平板，放置于待測環境中。密閉環境中的空氣微生物會在重力作用下自然沉降在落菌平板上，通過對平板內的微生物菌群進行分析，實現檢測及監測的目的。實際操作中，空氣中的微生物可以在培養基上形成單一的微生物菌落，根據菌落的數量可以計算微生物數量。

落菌平板的觀察方法較多，如顯微鏡法、基質輔助激光解吸電離法（MALDI）、激光誘導熒光法（LIF）等。顯微鏡法是最基本也是應用最普遍的落菌平板觀察方法，其借助顯微鏡對平板中的菌落及有機物質進行觀察，常用于液體樣本中的微生物觀察任務；MALDI是一種現代化軟電離技術，但受到信號強度的影響，只能對超過600 Da的微生物進行觀察，其主要是用來完成大分子顆粒的觀察任務；LIF是在一定角度下對落菌平板熒光輻射的二維或三維圖像進行分析，有選擇性地獲得微生物分子結構檢測結果，主要用于空氣微生物中的細菌檢測。

落菌檢測技術的優點在于造價低廉、操作方法較為容易、不需要工作人員一直守在待測環境中以及對于空氣微生物的損傷較小。但在收集過程中容易受到密閉環境的氣流、粒子大小、人體活動等情況的影響，其檢測結果存在一定的巧合性，不具備強有力的說服力。

2.4 撞擊檢測技術

撞擊檢測技術是當下較為普遍的民用密閉環境中空氣微生物檢測及監測技術。該技術基于空氣微生物檢測儀，在抽氣動力的作用下，使存在于空氣中的帶菌粒子在較為狹窄的縫隙中高速流動，并與介質表面進行接觸，于慣性作用下完成空氣微生物取樣。其中，直徑較小的空氣微生物粒子會直接通過采樣器，而直徑較大的空氣微生物粒子會被收集起來。就目前發展技術水平而言，撞擊檢測技術采樣后的器皿溫度通常保持在37 ℃，并在48 h內完成帶菌粒子檢測。撞擊檢測技術的采樣成本較低、操作簡單且培養基處理方便，能夠實現不同直徑帶菌粒子的分級采樣。但就密閉環境而言，其不能夠直接對空氣微生物的數量進行檢測，無法滿足全方位監測密閉環境中空氣微生物的要求。

2.5 液體檢測技術

液體檢測技術主要是針對密閉環境中的浮游微生物進行檢測，尤其是浮游細菌。取密閉環境中部分待測空氣注入無菌液體培養基中，采用菌液涂抹或倒平板的方法使其均勻分布，便于其在培養基上生長；經過一段時間的繁殖后，進行計數、分離、鑒定等工序。就原理而言，液體檢測技術與撞擊檢測技術有一定的相似性，區別在于液體撞擊技術是將空氣微生物收集到液態化的培養皿中。當待測空氣通過狹窄的通道管沖擊到液體培養皿上時，所有懸浮顆粒物都會被液體培養基收集起來，并放置于適宜的培養條件下進行微生物檢測。該過程會受到空氣沖擊風速的顯著影響。若沖擊風速為5 m/s，則收集效率在10%左右；而在靜止狀態下，收集效率則接近100%。液體檢測技術中，大多數液體沖擊采樣器都是由玻璃制成的，相較于安德森采樣器等金屬采樣器存在著造價較低的優勢，且液體培養基基質對于空氣微生物的損害程度較低。

2.6 酶抑制檢測技術

酶抑制檢測技術主要是通過商品化微量生化鑒定試劑盒來檢測密閉環境中的微生物殘留量，將樣本與反應試劑放入儀器中進行檢測反應，檢測儀會計算出密閉環境空氣樣本中的具體微生物數值。一般來說，若致病微生物檢驗結果低于10%，說明密閉環境中微生物含量符合標準，反之則說明環境中存在致病微生物殘留問題，需要進行滅毒殺菌處理。酶抑制檢測技術操作便捷，對檢測設備要求不高，簡單培訓即可進行檢測，且靈敏度高，檢測結果較有說服力，常用于細菌及真菌類微生物的檢測。但是，酶抑制檢測技術僅限于檢測某些特定微生物，其原理是通過酶的功能基因易于受到某種微生物的影響，從而在一定程度上降低酶自身的活性強度，導致其失去原有生理作用，進而達到檢測密閉環境中空氣微生物的效果。將酶抑制劑放置于空氣樣品環境中進行反應，根據酶抑制劑活性受到抑制的情況，分析密閉環境空氣樣本中所含微生物含量。酶抑制檢測是目前相對較為成熟的、應用較為廣泛的一種密閉環境空氣微生物檢測和監測方法，其實驗力度強、實驗結果具備說服力，但檢測環節使用的酶造價較為昂貴。若使用造價低廉的反應酶，其檢測結果還需要進一步驗證[5]。

3 結語

重視空氣微生物檢測和監測技術研究，全面了解空氣微生物的來源、種類、采樣方法和檢測方法，能夠有效控制密閉環境的空氣質量，改善特殊條件下的作業環境。隨著現代科技的不斷完善，微生物檢測技術也會越來越全面，從而不斷推進生物科學的現代化發展。