腐生絲狀嗜熱真菌分泌的嗜熱纖維素水解酶研究進展

張正盈，江賢章

（福建師范大學生命科學學院，福建福州 350117）

嗜熱真菌是一類在45～50 ℃高溫環境下生長良好的真菌。對嗜熱真菌分泌的酶進行研究，主要是為了研究他們在生物技術過程中的適用性，并探索常溫真菌和嗜熱真菌的酶在理化性質上的差異。腐生絲狀嗜熱真菌是嗜熱真菌的一個重要分支。腐生絲狀嗜熱真菌被認為是嗜熱酶的良好來源。腐生絲狀嗜熱真菌的基因組在編碼區的GC含量高于中溫真菌的GC含量，這一變化集中反映在密碼子的第三位。由于這一變化，腐生絲狀嗜熱真菌產生的嗜熱酶具有高溫適應性和熱穩定性，高催化活性，可以更強地抵抗變性劑并降低污染的發生率，對富含油脂、重金屬、植酸和多糖等的工業廢物和廢水具有生物修復作用。腐生絲狀嗜熱真菌可以用來生產淀粉酶、磷酸酶（包括植酸酶）、纖維素水解酶、蛋白酶等酶類。這些酶在食品、紡織和洗滌劑、乳品、制藥等工業中都有應用。本文對腐生絲狀嗜熱真菌分泌的三種主要嗜熱纖維素水解酶的應用以及分子領域的研究現狀的最新信息進行了綜述，使腐生絲狀嗜熱真菌更好地應用于生物技術的研究工作。

1 嗜熱纖維二糖脫氫酶

纖維二糖脫氫酶（CDH）又被稱為纖維二糖氧化酶，是一類黃素血紅素蛋白；1974年由Eriksson等人最早從Sporotrichum pulverulentum中發現，其相對分子量約為90 kDa，是一種對于pH和溫度較穩定的酶。在應用上，CDH可以提高纖維素酶的降解效率。嗜熱CDH的克隆和測序顯示該酶有3個結構域：一個含催化位點的N-terminal黃素結構域、中間血紅素結構域以及與里氏木霉的纖維素酶結合結構域同源的C-terminal結合結構域[1]。基于CDH序列分析，定義了四個系統發育類。這些類中CDHs在纖維素結合、底物特異性以及催化反應中結構域之間的電子轉移方面表現出不同的結構和催化性能。在之后的研究中對Ⅰ類和Ⅱ類CDH的結構、反應機理和動力學進行了詳細的表征。CDH的重組表達在生物傳感器、生物燃料電池、生物質水解及合成過程等多個領域得到應用。腐生絲狀嗜熱真菌產生的嗜熱性纖維二糖脫氫酶具有更好的酶活性以及熱穩定性，嗜熱纖維二糖脫氫酶在纖維素聚合、減少纖維素產物抑制以及抑制纖維素重聚合等方面都起到一定作用，可以進一步優化纖維素酶對于纖維素的降解作用。挖掘腐生絲狀嗜熱真菌中優質嗜熱纖維二糖水解酶，將在工業生產中具有巨大的應用前景。

2 嗜熱木聚糖酶

木聚糖酶（Xylanase）是一類降解木聚糖中β-1,4木糖苷鍵的酶系，對大量存在于自然界中的半纖維素具有重要作用。木聚糖酶普遍存在于甲殼類動物、植物、微生物中?，F如今，已測定了許多木聚糖酶基因完整的序列，如枯草桿菌W23的木聚糖酶基因序列。腐生絲狀嗜熱真菌產生的嗜熱木聚糖酶在工業紙漿生物漂白中具有一定優勢而受到關注。研究發現，從木質素-碳水化合物復合物中除去木聚糖從而促進木質素的浸出，消除了在紙漿漂白過程中對氯的需要[2]。另外，嗜熱木聚糖酶能使木質纖維素緊密吸附，具有較強的纖維素降解能力。嗜熱厭氧菌（Caldicellulosiruptor bescii）產生的嗜熱木聚糖酶屬于GH10家族，其底物特異性廣泛，有利于木質纖維素降解；嗜熱木聚糖酶也可用于動物飼料的預處理，以提高其消化率。一些經過純化的嗜熱木聚糖酶的結構已經被確定，并通過結晶進行結構分析。

3 嗜熱纖維素酶

木質纖維素是自然界中含量豐富的可再生資源，具有重要的經濟意義。纖維素酶是一類將纖維素降解為寡糖或葡萄糖的蛋白質，由多種水解酶構成，由內切葡聚糖酶（endo-1,4-β-D-glucosidase，EG）、外切葡聚糖酶（exo-1,4-β-D-glucosidase，CBH）、β-葡萄糖苷酶（β-1,4-glucosidase，BG）的協作來實現從纖維素到單糖的轉化。利用纖維素酶將木質纖維素轉化為增值產品是一種重要的策略[3]。在較高的溫度下，纖維素會膨脹，更容易斷裂。嗜熱纖維素酶目前成為高效降解生物質的關鍵酶。

腐生絲狀嗜熱真菌中含有種類豐富的纖維素酶。李多川等[4]克隆了嗜熱毀絲菌和嗜熱毛殼菌的cbh1基因和eg2基因，在畢赤酵母中進行異源表達，構建了pPIC9K-cbh1和pPIC9K-eg2表達載體，并通過不斷篩選獲得具有更高活性的嗜熱纖維素酶[5]。Jiang等人[6]評估了嗜熱毛殼菌（C.thermophilum）的木質纖維素降解能力，并將其與里氏木霉（Trichoderma reesei）的木質纖維素降解能力進行了比較。結果顯示，嗜熱毛殼菌顯示出更高的纖維素利用效率，而纖維素酶的產量相對較低，表示嗜熱毛殼菌中可能存在更好的纖維素酶。對兩種菌的主要纖維素酶纖維二糖水解酶Ⅰ（CBH1）進行比較，發現嗜熱毛殼菌的比活性比里氏木霉CBH1高約4.5倍。為了探討提高里氏木霉的CBH1活性是否有助于提高里氏木霉整體纖維素的利用效率，用嗜熱毛殼菌cbh1基因替代了里氏木霉cbh1基因。數據表明，該基因置換不僅使纖維二糖水解酶Ⅰ（CBH1）的活性增加了約4.1倍，還導致了其他纖維素酶基因的更強誘導作用。

4 展望

腐生絲狀嗜熱真菌在熱休克、氧化應激、膜生物合成、染色質結構和修飾以及真菌細胞壁代謝等嗜熱酶生產過程中存在差異，其主要原因尚不清楚。近年來，隨著生物能源市場需求的增加，對新型和改造后的工業酶以及高效酶的生產系統的探索逐漸深入。遺傳系統建立方面的研究成為目前研究的一個重要方向。許多細菌和真菌本身的產酶效果不理想，但是可以通過構建遺傳系統平臺，作為活性酶的遺傳庫。腐生絲狀嗜熱真菌在作為遺傳宿主上具有應用以及開發潛力。開發腐生絲狀嗜熱真菌遺傳操作系統將極大地提高嗜熱酶的產量以及嗜熱酶的利用效率。

5 結語

利用腐生絲狀嗜熱真菌開發基因遺傳表達工具，使腐生絲狀嗜熱真菌在生理條件下直接組裝并產生耐熱大分子復合物成為可能。該方法具有從腐生絲狀嗜熱真菌中獲得復雜嗜熱酶的巨大潛力，包括天然蛋白和RNA修飾。此外，這些嗜熱酶復合物具有的熱穩定性將有助于蛋白質之間的相互作用。因此，該方法不僅可以為腐生絲狀嗜熱真菌進一步發展成為生化模式生物提供基礎；并對復合嗜熱酶的結構進行預測分析提供可能。在腐生絲狀嗜熱真菌中開發基因遺傳表達工具將在生物技術方面成為一條嶄新的道路。