博落回根莖葉揮發油化學成分及抗菌活性研究

李春梅，劉 爽，邢 丹，劉冰梅，季宇彬*

(1.哈爾濱商業大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150070;2.哈爾濱商業大學 藥物研究所博士后科研工作站，黑龍江 哈爾濱 150070；3.濟寧醫學院醫學信息工程學院，山東 日照 276826;4.黑龍江省醫院南崗分院，黑龍江 哈爾濱 150001)

揮發油又稱芳香油或精油，是植物經水蒸氣蒸餾得到的揮發性油狀液體，主要由萜和芳香族化合物及其含氧衍生物組成，少數為脂肪族化合物和雜原子化合物[1]。揮發油是植物的一種次生代謝產物，因其化學組成的特殊性，具有較好的抗氧化、抗菌和殺蟲等生物活性，是新型低毒的抗氧化劑、殺菌防腐劑和天然香料的重要來源。揮發油在植物界中分布廣泛，其存在部位由于品種不同而表現不同，在植物根、莖、葉、花以及果實的某些器官中具有較高的含量。由于地理位置、環境、農藝條件或者晝夜節律的不同，同種植物的揮發油成分也表現出差異。我國具有豐富的植物資源，為揮發油的研究開發以及利用提供了很好的條件[2]。提取植物揮發油采用水蒸氣蒸餾法[3]，測定植物揮發油主要采用氣相色譜法[4]、高效液相色譜法、紫外分光光度法[5]以及近紅外光譜法[6]等。

博落回[Macleayacortada(Willd) R.Br.]是罌粟科多年生的高大的草本類植物[7]，在我國分布廣泛，因產地不同，而有不同的別名約20 多種。博落回的主要生物活性成分是異喹啉類生物堿[8]，可用來治療人、畜多種感染性疾病，具有抗菌[9]、消炎[10]、清熱解毒、增強免疫力、抗腫瘤[11]等多種作用。關于博落回的研究主要集中在生物堿成分的提取分離、含量測定以及藥理活性方面[12]，而對于博落回揮發油的藥理活性的研究[13]較少。鑒于此，作者采用水蒸氣蒸餾法對博落回根、莖、葉等3個部位的揮發油進行提取，利用氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[14]對其進行化學成分分析，并初步評價其抗菌活性，擬為博落回資源的開發利用提供科學依據。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

博落回鮮草，于 2018 年 10 月初采于貴州銅仁地區，經哈爾濱商業大學藥學院金哲雄教授鑒定為罌粟科博落回屬植物博落回(Macleayacortada(Willd)R.Br.)，儲存于哈爾濱商業大學藥學院標本室，標本號為20181046。將博落回鮮草的根、莖、葉、果實分開，自然陰干后，粉碎過 40 目篩，于 4 ℃冰箱中保存備用[15]。

氯化鈉，天津光復科技發展有限公司；無水乙醇，天津天力化學試劑有限公司；正己烷，天津富宇精細化工有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、碳酸鈉、無水硫酸鈉、乙醚等試劑均為分析純；超純水。

HP6890/5975C 型GC/MS聯用儀，美國安捷倫公司；R-201型旋轉蒸發器，上海申勝生物技術有限公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋，常州恒久儀器制造有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義予華儀器有限責任公司； FA2204B型電子天平，上海精科天美科學儀器有限公司；UV-2102PC型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；JP-040ST型潔盟牌超聲波清洗機，深圳潔盟清洗設備有限公司。

1.2 供試菌株

革蘭氏陽性菌：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) ATCC 6633、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) ATCC 27217、溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus) ATCC 29213；革蘭氏陰性菌：青枯病菌(Pseudomonassolanacearum) GMI 1000、農桿菌(Agrobacterium) ATCC 11158、大腸桿菌(Escherichiacoli) CMCC 44102；真菌：黑曲霉(Aspergillusniger) CMCC 98003；酵母菌:白色念珠菌(Candidaalbicans) ATCC 10231。

1.3 博落回根、莖、葉揮發油的提取[13]

分別稱取適量博落回根、莖、葉粉末置于圓底燒瓶中，加入蒸餾水浸泡過夜，揮發油測定器中加入一定量的正己烷，電熱套連續加熱，水蒸氣蒸餾至揮發油測定器中油量不再增加，停止加熱，靜置片刻，將水緩緩放出，收集正己烷層，常溫揮去部分溶劑，得到油相部分。水相部分加氯化鈉至飽和后，用無水乙醚萃取3次。將合并后的油相和乙醚萃取液用無水硫酸鈉脫水過濾，濾液用旋轉蒸發儀回收溶劑，即得具有特殊香味的淡黃色博落回揮發油，根、莖、葉揮發油得率分別為0.0476%、0.0575%、0.0703%，置于冰箱保存備用。

1.4 GC-MS 分析條件[13]

GC條件：色譜柱為ZB-5MSI-5%phenyl-95%dimethylpolysiloxane彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，柱溫50 ℃(保持2 min)，以5 ℃·min-1升溫至310 ℃(保持8 min)；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓52.5 kPa；載氣流量1.0 mL·min-1；分流比40∶1；溶劑延遲時間5.0 min。

MS條件：電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1 624 V；接口溫度280 ℃；質量范圍20～480 amu。

1.5 抗菌活性評價

1.5.1 菌株的培養

采用3株革蘭氏陽性菌(枯草芽孢桿菌ATCC 6633、金黃色葡萄球菌ATCC 27217和溶血性葡萄球菌ATCC 29213)、3株革蘭氏陰性菌(青枯病菌GMI 1000、農桿菌ATCC 11158、大腸桿菌CMCC 44102)、1株真菌(黑曲霉CMCC 98003)和1株酵母菌(白色念珠菌ATCC 10231)進行抗菌活性測定。細菌菌株在LB培養基(酵母膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，pH值 7) 中于37 ℃培養24 h；真菌和酵母菌在馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養基中于28 ℃培養48 h。供試菌懸液稀釋至106CFU·mL-1后用于檢測。

1.5.2 圓盤擴散實驗

博落回葉揮發油抗菌活性的測定采用標準圓盤擴散法。揮發油以10 mg·mL-1的初始濃度溶解于DMSO中，經0.45 μm微孔濾膜過濾后滅菌。向無菌試紙(直徑6 mm)注射10 mg·mL-1的揮發油溶液10 μL，置于平板上，細菌于37 ℃培養72 h，真菌和酵母菌于27 ℃培養48 h，測定抑菌圈直徑。使用1個空盤來測試盤是否無菌，以DMSO為陰性對照，慶大霉素(20 g/盤)為細菌陽性對照，制霉菌素(20 g/盤)為真菌和酵母菌陽性對照。

1.5.3 最小抑制濃度(MIC)的測定

采用連續肉湯稀釋法測定MIC。采用連續二倍稀釋法制備1 000～7.8 g·mL-1的揮發油溶液，加入到含有1 mL培養基的試管中，再分別加入20 mL供試菌懸浮液(106CFU·mL-1)。細菌、真菌和酵母菌于37 ℃培養24 h。

2 結果與討論

2.1 博落回根、莖、葉揮發油的化學成分及含量

按GC-MS分析條件，對博落回根、莖、葉揮發油進行檢測，得到博落回根、莖、葉揮發油的總離子流色譜圖，見圖1。

圖1 博落回根(a)、莖(b)、葉(c)揮發油的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion spectra of volatile oil from roots(a),stems(b),and leaves(c) of Macleaya cortada

對總離子流色譜圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對NIST2005和Wiley275標準質譜圖，并對檢索結果進行人工解析及查對文獻。采用峰面積歸一化法測定各化學成分的含量，結果見表1。

由表1可知，從博落回根揮發油中共鑒定出52種成分，占揮發油總含量的91.673%。其中含量較高的前10種成分依次是：棕櫚酸(21.033%)、肉豆蔻酸(8.917%)、鄰苯二甲酸丁酯(8.191%)、月桂酸(5.842%)、4-乙烯基-2-甲氧基-苯酚(4.874%)、鄰苯二甲酸二異辛酯(3.283%)、亞油酸(3.203%)、鄰苯二甲酸異丁酯(2.886%)、正十五碳醛(1.884%)、二十八烷(1.874%)。

表1 博落回根、莖、葉揮發油的化學成分及含量

續表1

續表1

從博落回莖揮發油中共鑒定出50種成分，占揮發油總含量的99.159%。其中含量較高的前10種成分依次是：棕櫚酸(37.516%)、正十五碳醛(8.741%)、鄰苯二甲酸丁酯(7.426%)、亞油酸(5.889%)、(E)-9，17-十八碳二烯醛(3.631%)、十九烷(3.568%)、肉豆蔻酸(3.509%)、鄰苯二甲酸二異辛酯(3.424%)、鄰苯二甲酸異丁酯(2.127%)、十五酸(1.941%)。

從博落回葉揮發油中共鑒定出68種成分，占揮發油總含量的92.549%。其中含量較高的前10種成分依次是：十六醛(20.628%)、葉綠醇(18.508%)、(9Z,12Z,15Z)-十八碳三烯醛(13.510%)、4-乙烯基-2-甲氧基-苯酚(8.723%)、棕櫚酸(4.334%)、β-紫羅蘭酮(2.962%)、二氫食用西番(2.725%)、6,10,14-trimethyl-pentadecanone(2.031%)、正十四碳烷(1.889%)、鄰苯二甲酸異丁酯(1.819%)。

博落回的根、莖揮發油中含量最高的成分均為棕櫚酸，根、莖揮發油成分種類比較接近，但葉揮發油成分與根、莖明顯不同，不同部位揮發油含量差異極大。從博落回根、莖、葉等3個部位的揮發油中共鑒定出96種化學成分，僅有24種成分是3個部位共有的，根、莖揮發油共有成分有41種，根、葉揮發油共有成分有30種，莖、葉揮發油共有成分有28種。根、莖、葉揮發油特有成分分別有6種、5種、35種。

2.2 博落回葉揮發油的抗菌活性(表2)

由表2可知，供試菌的抑菌圈直徑為(7.7±0.6)～(15.9±0.8) mm，MIC值為125～500 μg·mL-1。其中青枯病菌GMI 1000和金黃色葡萄球菌ATCC 27217對博落回葉揮發油的敏感性較高，其抑菌圈直徑分別為(15.9±0.8) mm和(15.1±1.0) mm，MIC值均為125 μg·mL-1。博落回葉揮發油對真菌和酵母菌也有抗菌活性，對細菌和真菌的抗菌活性呈劑量依賴性。博落回葉揮發油對供試菌的抑菌圈直徑與MIC值呈顯著正相關(P<0.05)。對照治療(DMSO)沒有顯示出抗菌活性。

表2 博落回葉揮發油的抗菌活性

2.3 討論

采用水蒸氣蒸餾法提取博落回揮發油，利用GC-MS法共鑒定出96種成分，可見博落回揮發油的化學成分比較復雜。博落回根、莖、葉等3個部位的揮發油成分存在極大差異，96種成分中，3個部位的共有成分只有24種，根、莖揮發油共有成分有41種，根、葉揮發油共有成分有30種，莖、葉揮發油共有成分有28種。根揮發油特有成分有6種，莖揮發油特有成分有5種，葉揮發油特有成分有35種。博落回葉揮發油的抑菌圈直徑為(7.7±0.6)～(15.9±0.8) mm，MIC值為125～500 μg·mL-1，說明博落回葉揮發油具有一定的抗菌活性。博落回揮發油中含有豐富的香料、藥用等化學成分，具有重要的開發利用價值。其中博落回葉揮發油的主要成分十六醛(棕櫚醛)(20.628%)主要用于調制化妝品香精，以及杏、桃、莓等果香型香精；(9Z,12Z,15Z)-十八碳三烯醛(13.510%)是美國白蛾性信息素中兩個主要成分之一，應用于預報、監測和防治美國白蛾等方面，并且已經獲得了較好的效果；β-紫羅蘭酮(2.962%)是一種極其重要的香料，用于皂用香精，也是合成維生素A的原料，常用于烘烤食品、冰凍乳制品、布丁。根、莖揮發油中的棕櫚酸(21.033%、37.516%)有較強的抗腫瘤作用，能引起人成骨肉瘤細胞MG63凋亡[16]。

3 結論

通過對博落回揮發油化學成分及抗菌活性的初探，發現博落回揮發油含有多種芳香族和不飽和脂肪酸、醛、酮和烯類成分，這些成分有廣泛的活性，有些已被用作名貴的香料，有些具有很好的藥用價值。從成分分析結果來看，有必要對博落回揮發油香味成分、防治害蟲和抗腫瘤活性進一步研究，為充分開發利用博落回資源提供科學依據。