熒光定量PCR測定粗品肝素鈉DNA提取液中反芻基因及豬基因的濃度

李 寧，李麗紅，米文強，張雪霞，任風芝*，劉建芬

(1.華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心河北省工業微生物藥物代謝工程技術中心，河北 石家莊 050015；2.華北制藥華坤河北生物技術有限公司，河北 石家莊 050000)

肝素鈉是由不同分子量糖鏈的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽組成的混合物[1]，是目前抗凝血和抗血栓的首選藥物[2]，還具有抗平滑肌細胞增殖、抗炎癥、抗腫瘤及抗病毒等多種生物學功能[3]。肝素鈉可以從豬、牛的小腸黏膜和牛肺等組織中提取，但由于瘋牛病的出現，使牛源肝素鈉的應用受到了限制[4]。不同動物來源的肝素鈉具有不同的化學結構和生物活性，其不良反應也不同，牛源肝素鈉引起血小板減少的不良反應約是豬源肝素鈉的2倍[5]。《中華人民共和國藥典》2020年版中明確規定，肝素鈉應從檢疫合格的豬腸黏膜中提取，并對肝素鈉的動物來源進行種屬鑒別[1]。因此，開發一種快速檢測粗品肝素鈉中反芻基因及豬基因的方法，對于判定肝素鈉的動物來源尤為重要。作者采用細胞裂解和蛋白酶K消化技術，結合DNA制備柱選擇性吸附DNA的方法提取粗品肝素鈉中的動物DNA，將DNA標準溶液、粗品肝素鈉DNA提取液分別與相應的PCR試劑混合，進行PCR擴增，測定粗品肝素鈉DNA提取液中反芻基因及豬基因濃度。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

粗品肝素鈉(豬源)，華北制藥華坤河北生物技術有限公司；粗品肝素鈉(羊源)，廣東賽格生物技術有限公司。

基因組DNA小量試劑盒(DNA制備柱、核糖核酸酶A、裂解液、蛋白酶K、蛋白去除液、洗滌液、去鹽液、洗脫液)，康寧生命科學(吳江)有限公司；反芻基因熒光PCR檢測試劑盒(反芻基因PCR試劑預混劑、雙蒸餾水、TE緩沖液、反芻基因組DNA對照品)、豬基因熒光PCR檢測試劑盒(豬基因PCR試劑預混劑、雙蒸餾水、TE緩沖液、豬基因組DNA對照品)、牛基因組DNA對照品、綿羊基因組DNA對照品、山羊基因組DNA對照品，廣東賽格生物技術有限公司。

ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀，美國應用生物系統公司；XW-80A型渦旋混合器，上海精科實業有限公司；TGL-20M型高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；水浴鍋，泰特實驗儀器廠。

1.2 粗品肝素鈉DNA提取液的制備

將1.0 g粗品肝素鈉用水溶解至10 mL，10 000 r·min-1離心5 min；取上清液100 μL于離心管中，加入250 μL雙蒸餾水、0.9 μL 核糖核酸酶A，渦旋混合30 s；然后加入150 μL裂解液，渦旋混合30 s，再加入20 μL 蛋白酶 K，渦旋混合30 s， 56 ℃水浴30 min，得消化液；向消化液中加入350 μL 蛋白去除液，輕輕搖勻，12 000 r·min-1離心10 min；上清液轉移至DNA制備柱中，靜置5 min后，12 000 r·min-1離心1 min；棄去濾液，DNA制備柱用500 μL洗滌液離心洗滌后，用去鹽液離心洗滌2次，每次700 μL；最后在DNA制備柱中加入150 μL 65 ℃預熱的洗脫液，靜置2 min，離心，收集洗脫液至潔凈的滅菌離心管中，得粗品肝素鈉DNA提取液，即供試溶液。

1.3 DNA標準溶液的配制

1.3.1 反芻基因組DNA標準溶液的配制

取10 ng·μL-1反芻基因組DNA標準溶液，用TE緩沖液稀釋至濃度分別為1 000 pg·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、0.1 pg·μL-1、0.01 pg·μL-1的反芻基因組DNA標準溶液。

1.3.2 豬基因組DNA標準溶液的配制

取10 ng·μL-1豬基因組DNA標準溶液，用TE緩沖液稀釋至濃度分別為10 000 pg·μL-1、1 000 pg·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、0.1 pg·μL-1的豬基因組DNA標準溶液。

1.4 熒光定量PCR擴增檢測

1.4.1 反應液的配制

按每孔PCR試劑預混劑11.5 μL、雙蒸餾水6.5 μL的比例分別混合稀釋反芻基因PCR試劑預混劑及豬基因PCR試劑預混劑；將粗品肝素鈉DNA提取液與DNA標準溶液按2 μL/孔分別添加至對應的PCR反應孔中，混合均勻。

1.4.2 測試程序

PCR擴增程序：95 ℃ 120 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個循環。計算溶液中反芻基因及豬基因濃度。

2 結果與討論

2.1 反芻基因PCR試劑和豬基因PCR試劑的專屬性

在反芻基因PCR試劑和豬基因PCR試劑中分別加入牛基因組DNA標準溶液、綿羊基因組DNA標準溶液、山羊基因組DNA標準溶液、豬基因組DNA標準溶液、雙蒸餾水(空白對照)，進行PCR擴增，考察反芻基因PCR試劑和豬基因PCR試劑的專屬性，結果見表1。

表1 反芻基因PCR試劑和豬基因PCR試劑的專屬性

從表1可知，反芻基因PCR試劑對牛基因組DNA、綿羊基因組DNA、山羊基因組DNA可正常擴增，結果均為陽性；對豬基因組DNA、空白對照的擴增結果均為陰性。豬基因PCR試劑對豬基因組DNA正常擴增，結果為陽性；對牛基因組DNA、綿羊基因組DNA、山羊基因組DNA與空白對照的擴增結果均為陰性。表明反芻基因PCR試劑和豬基因PCR試劑的專屬性滿足檢測要求。

2.2 線性范圍

2.2.1 反芻基因濃度的線性范圍

以濃度為0.01～1 000 pg·μL-1的反芻基因組DNA標準溶液為模板進行PCR擴增，以雙蒸餾水為空白對照。以反芻DNA濃度的對數(logc)為橫坐標、擴增CT值為縱坐標，繪制標準曲線(圖1)，擬合得線性回歸方程為：CT=-3.46logc+25.95，R2=0.9990，擴增效率=94.54%。表明反芻基因濃度在0.01～1 000 pg·μL-1范圍內與擴增CT值線性關系良好。

圖1 反芻基因的標準曲線Fig.1 Standard curve of ruminant gene

2.2.2 豬基因濃度的線性范圍

以濃度為0.1～10 000 pg·μL-1的豬基因組DNA標準溶液為模板進行PCR擴增，以雙蒸餾水為空白對照。以豬DNA濃度的對數(logc)為橫坐標、擴增CT值為縱坐標，繪制標準曲線(圖2)，擬合得線性回歸方程為CT=-3.18logc+32.63，R2=0.9952，擴增效率=106.11%。表明豬基因濃度在0.1～10 000 pg·μL-1范圍內與擴增CT值線性關系良好。

2.3 準確度

2.3.1 反芻基因檢測準確度

分別將濃度為10 000 pg·μL-1、1 000 pg·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1的牛基因組DNA標準溶液與粗品肝素鈉DNA提取液按1∶9的比例混合，作為模板進行PCR擴增，結果見表2。

由表2可知，反芻基因的平均回收率為107.66%，RSD為7.11%，表明該方法測定反芻基因濃度的準確度滿足檢測要求。

圖2 豬基因的標準曲線Fig.2 Standard curve of porcine gene

表2 反芻基因檢測準確度

2.3.2 豬基因檢測準確度

分別將濃度為10 000 pg·μL-1、8 000 pg·μL-1、6 000 pg·μL-1、4 000 pg·μL-1、2 000 pg·μL-1的豬基因組DNA標準溶液與粗品肝素鈉DNA提取液按1∶9的比例混合，作為模板進行PCR擴增，結果見表3。

表3 豬基因檢測準確度

由表3可知，豬基因的平均回收率為105.92%，RSD為7.77%,明該方法測定豬基因濃度的準確度滿足檢測要求。

2.4 精密度

取1批豬源粗品肝素鈉與1批羊源粗品肝素鈉等比例混合均勻，由 2 名實驗人員在不同時間分別制備供試溶液6份，測定反芻基因與豬基因濃度，結果見表4。

由表4可知，反芻基因和豬基因濃度的RSD分別為7.01%、5.60%，表明該方法的精密度滿足檢測要求。

表4 檢測精密度

2.5 穩定性

取1批豬源粗品肝素鈉與1批羊源粗品肝素鈉等比例混合均勻，制備供試溶液，將DNA標準溶液、供試溶液于(4±2) ℃分別放置0 h、12 h、24 h、36 h、48 h，測定反芻基因與豬基因濃度，結果見表5。

表5 供試溶液的穩定性

由表5可知，反芻基因和豬基因濃度的RSD分別為3.16%、4.62%，表明DNA標準溶液和供試溶液于(4±2) ℃放置48 h內穩定。

2.6 樣品測定

對3批粗品肝素鈉進行檢測，批號MHC190601、MHC190602、MHC190603的樣品中反芻基因濃度分別為3.02×10-2pg·μL-1、3.21×10-2pg·μL-1、1.64×10-2pg·μL-1，豬基因濃度分別為604.81 pg·μL-1、1 063.24 pg·μL-1、886.60 pg·μL-1。

3 結論

采用細胞裂解和蛋白酶K消化技術，結合DNA制備膜選擇性吸附DNA的方法，可同時處理多個樣品，快速提取粗品肝素鈉中的動物DNA。將DNA標準溶液分別與含有針對豬或反芻動物特有基因序列設計的探針、引物的PCR試劑混合，進行PCR擴增，反芻基因濃度在0.01～1 000 pg·μL-1范圍內線性關系良好，豬基因濃度在0.1～10 000 pg·μL-1范圍內線性關系良好。該方法具有良好的專屬性、準確度、精密度，適用于粗品肝素鈉動物來源的種屬鑒別。