非小細胞肺癌患者鉑類藥物化療前后RMB5基因表達的變化及化療預后分析

林杰勛 徐象威 張鵬海 朱佩禎 陳銀巧 奚一源

肺癌是我國發病率和病死率最高的一種惡性腫瘤，一項調查報道2015年約有733 300例新發的肺癌病例和610 200例死亡病例[1]。其中非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）仍是我國肺癌的主要類型，且常在發現時就已處于晚期。盡管近年來手術方案不斷革新，靶向治療、免疫治療不斷應用于臨床，但是其5年生存率仍不足17%[2-3]。特別對于鱗癌及EGFR基因未突變的患者，含鉑類藥物化療方案仍是晚期NSCLC的一線抗腫瘤治療方案之一[4]。鉑類化合物與細胞核內DNA結合，形成DNA-鉑類配合物引起DNA損傷，從而誘導腫瘤細胞的凋亡。但是由于肺癌對鉑類藥物的天然耐藥或繼發性耐藥可對藥物的臨床療效和患者的遠期預后造成嚴重影響。已有研究表明，凋亡缺陷是腫瘤細胞對順鉑產生耐藥的主要機制之一[5]。有研究發現，RBM5基因是人體內一種重要的抑癌基因，在諸多腫瘤細胞中，RBM5調控許多基因的mRNA前體的選擇性剪切，可以調控細胞分化、細胞周期以及細胞凋亡等細胞代謝過程，與腫瘤的發生、發展關系密切[6-7]。外源性高表達RBM5可以促進腫瘤細胞的凋亡及G1期周期阻滯，抑制腫瘤細胞的增殖，逆轉肺癌耐藥。當前對于RBM5的研究多為體外基礎研究，本研究從臨床實際病例中分析NSCLC患者鉑類化療前后RBM5 mRNA表達情況，評估其與化療療效以及無進展生存期（progression-free survival，PFS）的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年2月至2017年8月永康市第一人民醫院腫瘤內科收治的接受含鉑類藥物化療方案的晚期NSCLC患者52例，其中男37例，女15例，年齡43～78（64.35±8.92）歲。納入標準：（1）年齡 18～80 歲；（2）入組前均經氣管鏡或經皮肺穿刺或胸水及痰查脫落細胞學明確病理類型的NSCLC患者，經CT、MRI檢查證實具有一處及以上可測量腫瘤病灶，可根據國際抗癌聯盟TNM分期進行分期；（3）EGFR基因未見突變，未使用靶向治療藥物；（4）治療方案均以鉑類化療藥物為主的聯合化療，且化療至少4個周期的患者；（5）患者心電圖、肝腎功能檢查正常，均能達到化療的基本要求，預計生存期＞3個月，Karnofsky功能狀態評分≥60分。排除標準：（1）同時具有2種以上原發腫瘤患者；（2）曾接受放射治療或手術治療患者；（3）嚴重肝腎、心功能不全患者。剔除標準：（1）研究期間發生嚴重不良事件、并發癥和特殊病情變化不宜繼續接受調查者；（2）患者或家屬不愿繼續配合并退出者。所有患者均簽署書面知情同意書，本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法 于患者入院時記錄一般資料，包括性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤類型、臨床分期、體力活動狀態（performance status，PS）評分等。所有患者確診后均給予標準的含鉑類聯合化療方案，包括長春瑞濱+順鉑、紫杉醇+順鉑/卡鉑、吉西他濱+順鉑/卡鉑、多西他賽+順鉑/卡鉑、培美曲賽+順鉑/卡鉑。通過評估患者血常規、肝腎功能、心電圖等檢查結果，確認患者化療耐受性，當接受鉑類化療的患者出現疾病突然惡化或患者無法承受化療藥物毒性時，鉑類化療即時終止。進行4個周期化療后，通過腫瘤標志物、B超、胸部CT或MRI等檢查評估患者化療療效。療效按實體瘤標準判定[7]：分為完全緩解（CR），部分緩解（PR），無變化（SD），疾病進展（PD）。其中有效率（RR）＝[（CR+PR）/（CR+PR+SD+PD）]×100%，穩定率（CBR）＝[（CR+PR+SD）/（CR+PR+SD+PD）]×100%。患者經鉑類化療后表現為CR或PR被定義為高反應（17例），SD或PD被定義為低反應（35例），兩組患者性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤類型、臨床分期、PS評分比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。同時，抽取患者初次化療前及化療4個周期后靜脈血，置于-70℃超低溫冰箱保存。

表1 兩組患者一般資料對比（例）

1.2.1 RBM5 mRNA表達量檢測 采用qRT-PCR法。總RNA的提取采用RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒（北京天根生化有限公司，批號：Q5812）。采用反轉錄試劑盒（中國 Thermo Fermentas公司，批號：00314979）將RNA逆轉錄合成第1條鏈。引物合成由上海生工生物工程有限公司合成：P1:ACACGATGGATGGAAGCCA；P2:TCTGCTCTGCCTCTGACTT。按照 KAPA SYBRRFAST Real-time PCR Kit的反應體系于ABI 7300 qPCR儀上完成基因檢測。以β-action為內參，采用相對定量法（ΔΔCt）對實時熒光定量PCR產物進行比較。公式如下：ΔCt=Ct均值（目的基因）－Ct均值（管家基因），ΔΔCt=實驗組 ΔCt－對照組 ΔCt，差異倍數=2-ΔΔCt。

1.2.2 預后情況評估 采用電話隨訪、門診或住院病歷系統查詢等方式。研究主要觀察終點為PFS，定義為自首次化療后至隨訪終止或疾病復發或轉移的時間，主要通過醫院信息系統或患者直系親屬電話確認，末次隨訪截止2018年10月31日。患者在化療療程結束后每2個月隨訪1次。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以表示，化療前后比較采用配對t檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者化療療效評價 52例患者經過4周期化療后，通過B超、腫瘤標志物、胸部MRI等檢查評估患者化療療效。其中CR 4例，PR 13例，SD 18例，PD 17例。治療4周期后，RR為32.69%，CBR為67.30%。

2.2 不同療效及高反應、低反應組患者化療前后RBM5 mRNA表達量比較 不同療效組患者化療前RBM5 mRNA表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。化療后，CR組、PR組RBM5 mRNA表達量均明顯高于化療前，差異均有統計學意義（均P＜0.05），而PD組患者RBM5 mRNA表達量明顯低于化療前，差異有統計學意義（P＜0.01）。化療后各療效組比較差異有統計學意義（P＜0.01），且SD、PD組 RBM5 mRNA表達量均明顯低于CR、PR組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見表2。

高反應、低反應組患者化療前RBM5 mRNA表達比較差異無統計學意義（P＞0.05）。化療后，高反應組RBM5 mRNA表達較化療前明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01），而低反應組RBM5 mRNA表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01），且高反應組RBM5 mRNA表達明顯高于低反應組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表3。

表2 不同療效患者化療前后RBM5 mRNA表達量比較

表3 高反應、低反應組患者化療前后RBM5 mRNA表達量比較

2.3 NSCLS患者化療后不同療效及高反應、低反應與PFS的關系分析 按照化療后療效情況，分析不同療效患者的生存曲線，CR組患者中位PFS為8.35個月，PR組患者為7.80個月，SD組患者為6.70個月，PD組患者為6.80個月，4組比較差異無統計學意義（χ2=6.257，P＞0.05），見圖1。按照化療后反應情況，分析化療高、低反應患者的生存曲線，高反應組與低反應組的中位PFS分別為7.8個月與6.7個月，兩組比較差異有統計學意義（χ2=5.796，P＜0.05），見圖 2。

3 討論

鉑類藥物作為治療肺癌最有效的一線化療藥物，使用率達40%，其主要作用于細胞DNA、RNA和蛋白質，屬于細胞周期非特異性藥物[8]。多數患者在化療初期對化療藥物敏感，腫瘤體積縮小，臨床癥狀減輕，但隨著化療周期的增多，臨床療效逐漸不佳，腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性[9]。近年來，已有研究發現鉑類藥物對DNA產生不可修復的損傷可激活凋亡通路殺滅腫瘤細胞，細胞凋亡信號傳導通路中的任何環節功能受抑制或失活均能夠誘導腫瘤細胞對鉑類藥物產生耐藥性[10]。

圖1 不同療效患者的生存曲線比較（CR為完全緩解；PR為部分緩解；SD為無變化；PD為疾病進展）

圖2 高反應、低反應患者的生存曲線比較

RBM5，又稱為Luca15或H37，其基因定位于染色體3p21.3區域，是近年來發現的抑癌基因，與肺癌密切相關[11]。在多種惡性腫瘤細胞中（特別是肺癌），RBM5通過調控mRNA前體的選擇性剪切，介導細胞凋亡與促凋亡蛋白表達上調、抗凋亡蛋白表達下調、線粒體細胞色C素釋放進入細胞液增加和caspase家族活化增加，也可調節其他多種細胞內信號轉導和生物學行為[12-13]。邵晨[14]研究發現，肺癌組織上RBM5呈現低表達，且凋亡抑制蛋白表達明顯增高。同時通過對肺腺癌的體內、體外實驗研究證實，RBM5可通過誘導細胞凋亡及抑制細胞增殖的共同作用來抑制肺腺癌生長。當前關于RBM5在肺癌組織上的表達及其功能方面的研究目前僅有少數報道，且多數局限于細胞株上的研究。在多種惡性腫瘤細胞株中，過表達RBM5可抑制細胞凋亡，并通過使細胞周期停滯在G1期來抑制細胞增殖[15-16]。在Su等[17]研究中RBM5在其耐藥細胞A549/DDP中表達下調，而RBM5基因導入該細胞株后，其對順鉑的敏感性顯著增加。在Loiselle等[18]研究中也發現了RBM5可以降低小細胞肺癌的生長，增加順鉑的敏感性，并調節關鍵的轉化相關通路。本研究從臨床實際病例中分析NSCLC患者鉑類化療前后RBM5 mRNA表達量情況，評估其與化療療效以及生存期間的關系，通過對比不同化療患者化療前RBM5 mRNA表達情況發現，療效為CR、PR的患者RBM5 mRNA表達量較化療前有升高，而SD、PD的患者較前下降。同時生存情況，CR組中位PFS最高，但由于例數太少，導致與SD、PD組比較差異無明顯意義，而化療高反應組中位PFS明顯長于低反應組，說明化療越好，患者生存時間越長。

綜上所述，NSCLC患者經鉑類化療后，不同患者對鉑類藥物具有不同的敏感性，從而出現不同的療效及預后，化療療效好的患者RBM5 mRNA呈現高表達，且生存期較長。鉑類藥物可誘導NSCLC患者RBM5 mRNA表達的改變，檢測其表達量對于判斷NSCLC患者化療效果與預后具有一定的參考價值。在今后的研究中可對RBM5對腫瘤耐藥的調控機制進一步研究，以期為今后臨床開展克服腫瘤多藥耐藥提供更多依據。