細胞學標本BRAFV600E檢測對常規穿刺活檢難以定性診斷的甲狀腺結節的應用價值

龔偉 黃淵 程楓 趙歡 陳國榮

隨著高清B超檢查應用的普及，甲狀腺結節的診斷率越來越高。超聲引導下的細針穿刺活檢是甲狀腺結節診斷中的重要一環。雖然該法準確性高、可重復進行且費用低廉，臨床上已廣泛應用[1]，但甲狀腺結節的確診仍然受到許多因素（比如結節的大小、性質、位置、獲得的細胞學材料的數量以及涂片的質量等）的影響，有15%～30%診斷不能明確，這對臨床醫生作出是否手術的決定是一個巨大的挑戰[2]。甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺最常見的惡性腫瘤，BRAFV600E突變是其特異性生物標志，在組織學檢測上具有極高的陽性預測值（95.5%～100.0%）[3]，中國的甲狀腺乳頭狀癌中BRAFV600E突變率為72.4%[4]，因此采用細胞學材料來檢測BRAFV600E突變則具有十分重要的意義。本文旨在探討當常規穿刺細胞學難以定性診斷甲狀腺結節時，采用相應的細胞學標本檢測BRAFV600E突變狀態的應用價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年3月到2019年3月在麗水市中心醫院同時進行甲狀腺結節穿刺和甲狀腺切除手術的患者795例，細胞學診斷根據甲狀腺細胞病理學Bethesda報告系統（TBS診斷報告系統）分類：1類為標本無法診斷或標本不滿意，2類為良性，3類為意義不明確的細胞非典型病變或意義不明確的濾泡性病變，4類為濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤，5類為可疑惡性腫瘤，6類為惡性腫瘤。本研究共納入經甲狀腺TBS診斷為3、4、5類的患者135例作為研究對象，其中男27例，女 108 例，年齡 28～81（53.6±12.8）歲。本研究經麗水市中心醫院醫學倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 方法 B超下定位，用無負壓25G針以約3次/s的頻率針吸甲狀腺結節，每個可疑結節針吸3次，涂片后迅速固定于95%乙醇溶液中，用于HE染色，多余材料打入新柏液基保存瓶作薄層細胞病理學檢查。將細胞學材料用干凈的刀片刮下，對BRAFV600E的變異進行檢測。為了明確在不能明確診斷細胞學（TBS 3、4、5類）中分子測試的臨床意義，將細胞學中出現BRAF突變且術后證實為甲狀腺乳頭狀癌者定義為真陽性；無BRAFV600E突變，術后也沒有組織學惡性證據者定義為真陰性；有BRAFV600E突變，但術后證實為良性者定義為假陽性；細胞學材料中無BRAFV600E突變，但是組織學證實為惡性者則定義為假陰性。分別計算靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值以及準確率。其中3、4類惡性風險低于5類，且3、4類的處理與5類的不同，前者多為觀察或診斷性切除，后者則多手術切除。因此將3、4類的62例患者歸為組1，5類的73例患者為組2。在135例患者中75例為組織學證實的惡性腫瘤，其中70例為甲狀腺乳頭狀癌，5例為濾泡癌。在這70例乳頭狀癌中，BRAF突變56例，3類2例，5類54例，分別分析BRAFV600E突變與B超各項特征的關系。

1.3 BRAFV600E的突變檢測 采用熒光PCR（ARMS）法。首先將看過的細胞學涂片放置二甲苯浸泡5 min，脫去樹脂及蓋玻片，再分別經過二甲苯5 min，2道無水乙醇（各3 min），自然晾干后，將細胞學材料用干凈的刀片刮下，進行消化過程，提取DNA。準備好試劑盒中的反應混合液和陽性質控品，上樣DNA，離心或者輕甩8聯PCR反應管，使得所加試劑聚集到反應管底部，并將反應管置入實時PCR儀器，進行3個階段的擴增程序，在第3階段60℃收集信號，執行實時PCR。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

組1和組2的細胞學標本BRAFV600E突變診斷的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和診斷準確率見表1。組1和組2的真陽性個數、真陰性個數、假陽性個數和假陰性個數見表2、3。B超特征BRAFV600E突變的關系分析見表4，其中BRAFV600E突變與結節回聲質地、結節的大小均有關（均P＜0.05），與其余指標則均無關（均P＞0.05）。組1、組2與BRAFV600E突變的關系見表5。細胞學標本中BRAF野生型和突變型分別見圖1、2。

表1 組1和組2的細胞學標本BRAFV600E突變診斷甲狀腺癌的參數（%）

表2 組1 BRAFV600E突變的四格表參數（例）

表3 組2 BRAFV600E突變的四格表參數（例）

3 討論

進入分子病理時代后，分子檢測已成為腫瘤診斷、治療和患者預后的重要輔助手段。目前已知BRAF基因是人類最重要的原癌基因之一。BRAFV600E的突變可導致RAF/絲裂原活化蛋白激酶信號通路的持續激活，從而引起腫瘤細胞的分化增殖、代謝和生長的改變，是甲狀腺乳頭狀癌最常見的基因變異，而超聲診斷惡性占所有甲狀腺結節的7%～15%，其中甲狀腺乳頭狀癌就占了85%～90%[5]。在臨床實踐中，單純靠B超分流甲狀腺結節患者已經無法滿足臨床醫生的要求，因此在B超定位下的細針穿刺已成為評價甲狀腺結節的重要手段。但是由于不可抗拒的因素，細胞學的3、4、5類的診斷是無法避免的，且3、4類的診斷惡性風險低，其中3類的惡性風險為6%～18%，5類的惡性風險為45%～60%[6]。

表4 70例乳頭狀癌患者一般資料及BRAF突變與B超影像學的關系[例（%）]

表5 組1和組2 BRAFV600E突變的關系（例）

本研究中，組1中檢測BRAFV600E的靈敏度并不高，但是組1和組2具有100.0%的特異度和陽性預測值，這與相關文獻的數據是符合的，因此在細胞學材料中加做BRAFV600E可以有效地幫助確診乳頭狀癌，避免患者的手術延誤[7]。在BRAF陰性的情況下，結合B超、PET-CT等檢查手段則可以極大地減少不必要的手術。比較組1和組2中BRAFV600E突變的檢測率具有統計學意義，進一步說明了5類細胞學診斷發生惡性風險高于3類診斷。

甲狀腺癌中BRAFV600E的突變流行率取決于以下幾個因素：地理環境、種族和碘的攝入，其中亞洲人群BRAFV600E的突變率最高（84.5%），西方人群最低（30%～50%）[8]。BRAFV600E的突變與甲狀腺乳頭狀癌的亞型相關，80%～100%的高柱狀亞型乳頭狀癌（罕見）、45%～68%的經典型乳頭狀癌（常見）和高達12%～18%的濾泡亞型乳頭狀癌中出現BRAFV600E突變[9]。而在中國，大多數的甲狀腺癌為經典型乳頭狀癌，因此大多數的情況下，穿刺細胞學難以定性診斷的患者多涉及到甲狀腺乳頭狀癌與良性病變的鑒別診斷。細胞學標本上進行BRAFV300E檢測的診斷價值隨地理環境和種族的不同而產生變化。在西方，該診斷的靈敏度下降到40%，盡管理論上特異度和陽性預測值仍然不變。而在亞洲人群中，甲狀腺乳頭狀癌BRAFV300E突變率高，這使在細胞學標本上進行BRAFV300E的檢測具有更加重要的意義。

圖1 細胞學標本BRAFV600E野生型

圖2 細胞學標本BRAFV600E突變型

本研究在B超特征與BRAFV600E突變的關系中，結果顯示除了回聲質地和結節大小外，其他參數與BRAFV600E的關系不大。有相關文獻報道，認為BRAFV600E的突變與B超特征無關[10-11]，但是也有文獻指出BRAFV600E的突變與常見的可疑B超特征是相關的，它包括縱橫比失調、邊界不清、低回聲、微鈣化和空暈的缺失,當≥3個可疑B超特征同時出現時，BRAFV600E的陽性預測值可達82%[12]。不管怎樣，由于本研究樣本量偏小，且只局限于分析不能明確診斷的結節中BRAFV600E突變，故B超特征與BRAFV600E的關系需要更進一步的廣泛研究來證實。

綜上所述，對于常規穿刺細胞學難以明確性質的甲狀腺結節，采用細胞學標本的BRAFV600E檢測對于外科醫生作出相應的臨床處理具有重要的意義，可減少延誤手術的機會，可在具有分子病理實驗室的醫院推廣使用。