miRNA-155對慢性心力衰竭的診斷效能及其與 β-catenin mRNA通路的相關性研究

蔣健剛 季寧寧 杜曉馬 蘭景良 葛曉平

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多數心血管疾病患者死亡的主要原因，隨著我國人口結構的變化，其發生率、致殘率和致死率不斷增長，嚴重影響患者健康[1]。CHF臨床癥狀缺乏特異度，合并其他疾病時其臨床表現更為復雜，確診和預后評估難度也更大[2]。因此，如何實現CHF的早期診斷、危險分層并及時干預已成為當前研究熱點[3]。microRNAs（miRNAs）是一類內源性單鏈非編碼RNA，其長度為18～25核苷酸，能降解靶信使RNA（mRNA）或抑制轉錄后翻譯，從而調控基因表達[4]。miRNA-155是非編碼RNA的一種，在CHF患者中呈高表達，且其表達水平與患者疾病嚴重程度存在相關性。β-catenin是Wnt信號通路中重要的調節蛋白，在靜止細胞中可與E-Cadherin細胞內部結合，穩定細胞黏附，在Wnt信號激活中發揮重要作用[5-6]。本研究探討miRNA-155在CHF患者中的診斷效能及與β-catenin通路的相關性，報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2018年4月至2020年4月金華市中醫醫院收治的CHF患者67例為觀察組，其中男40例，女 27 例，年齡 42～76（59.85±5.61）歲；冠心病 41例，高血壓病11例，擴張型心肌病10例，風濕性心臟病5例；心功能分級 Ⅱ級26例，Ⅲ級30例，Ⅳ級11例，均經心臟超聲、實驗室等檢查確診[7]。并選擇同期治療的非CHF心血管疾病患者45例作為對照1組，男26 例，女 19 例，年齡 41～78（60.12±5.67）歲；冠心病 29例，高血壓7例，擴張型心肌病6例，風濕性心臟病3例。另選擇同期健康體檢者39例作為對照2組，其中男 21 例，女 18例，年齡 41～78（59.73±5.65）歲。排除標準：（1）合并結締組織疾病及急慢性感染者；（2）合并認知功能異常、急慢性腦血管疾病者；（3）肝腎功能異常或合并自身免疫系統疾病、血液系統疾病；（4）各種類型的腫瘤患者。3組對象性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究通過金華市中醫醫院倫理委員會審核批準（批號：20180126016）。所有對象均簽署知情同意書。

1.2 方法 3組研究對象均空腹抽取外周靜脈血5 ml，分離血清后放置在-80℃冰箱中備用。檢測方法：取300 μl血清，采用Trizol法（試劑盒購自北京天根生化有限公司）提取總的RNA，將其溶于DRPC溶液中，用Narodrop法檢測濃度和純度。取1 μg的總RNA為模板，進行反轉錄cDNA的合成，得到目標cDNA后進行qRT-PCR反應（試劑盒購自大連寶生物工程有限公司）。整個反應體系總容量為20 μl，包括模板cDNA 1 μl、上下游引物各 1 μl、Taq 聚合酶 0.15 μl、dNTPs 1 μl、2×SYBR Green mix 10 μl加 DEPC H2O 7 μl。反應條件為30℃下10 min；42℃下30 min；99℃下5 min；5℃下5 min，連續進行35個循環，72℃溫控下延長10 min。引物由上海生工生物有限公司合成，見表1。miRNA-155和β-catenin均選用β-actin為內參基因，反應結果用相對對量法（2-ΔΔCt法）計算 miRNA-155 和 β-catenin的相對擴增倍數。

1.3 統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件，計量資料以表示，多組比較采用方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。繪制ROC曲線，分析miRNA-155、βcatenin mRNA通路在CHF患者中的診斷效能（靈敏度、特異度）；采用Pearson相關對CHF患者miRNA-155與β-catenin mRNA通路表達水平的相關性進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組研究對象miRNA-155、β-catenin mRNA表達水平比較 見表2。

表1 qRT-PCR引物序列

表2 3組研究對象miRNA-155、β-catenin mRNA表達水平比較

由表2可見，3組間miRNA-155和β-catenin mRNA表達水平不同，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。各組間比較發現，觀察組miRNA-155表達水平高于對照1組和對照2組，β-catenin mRNA表達水平低于對照1組和對照2組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；對照1組miRNA-155表達水平高于對照 2組，βcatenin mRNA表達水平低于對照2組，差異均有統計學意義（均 P＜0.05）。

2.2 miRNA-155、β-catenin mRNA通路表達水平對CHF的診斷效能 見表3。

表3 miRNA-155、β-catenin mRNA通路表達水平對CHF的診斷效能

由表3可見，miRNA-155、β-catenin mRNA 通路聯合測定對CHF患者的診斷靈敏度、特異度均高于單一miRNA-155、β-catenin mRNA通路測定，差異均有統計學意義（均 P＜0.05）。

2.3 CHF患者miRNA-155與β-catenin mRNA通路表達水平的相關性 見圖1。

圖1 CHF患者miRNA-155與β-catenin mRNA通路表達水平相關性

由圖1可見，Pearson相關分析結果表明：CHF患者miRNA-155表達水平與β-catenin mRNA通路的表達水平呈負相關（r=-0.783，P＜0.05）。

3 討論

CHF是多種心臟疾病發展到后期的一種臨床綜合征，主要表現為運動耐量的顯著下降、明顯的體液潴留及乏力、納差等，其發病率隨年齡增長而顯著增加，嚴重影響患者的生活質量。因此早期準確診斷和評估病情，或將給CHF患者帶來巨大獲益[8]。miRNAs是由18～25個核苷酸構成的內源非編碼單鏈小分子RNA、不僅具有結構、序列的高度保守性，而且可以直接參與機體的發育、分化[9]。既往研究表明：miRNAs能與靶mRNA尾隨序列不完全/完全雜交方式結合，抑制mRNA的翻譯，從而發揮作用[10]。每一個miRNA能調節多個不同的mRNA表達，并且同一個mRNA亦可由多個miRNAs調節。新近研究表明[11]：miRNAs能直接參與細胞的增殖、分化及凋亡，且多種疾病的病理過程均伴有miRNAs表達水平異常。由此可見：miRNAs能抑制下游基因表達直接參與疾病的發生、發展。miRNA-155屬于miRNAs家族一員，不僅能促進動脈粥樣硬化的形成，亦可通過Rheb/mTOR調節SK6基因的表達，加劇心力衰竭的發生、發展[12]。在本研究中，觀察組miRNA-155表達水平均高于對照1組和對照2組，βcatenin mRNA表達水平均低于對照1組和對照2組；對照1組miRNA-155表達水平高于對照2組，βcatenin mRNA表達水平低于對照2組；這些均提示miRNA-155在CHF患者中呈高表達，可能可以直接參與疾病的發生、發展。miRNA-155在CHF患者中呈高表達，有望成為一種全新的預測CHF病情的生物標志物。在本研究中，ROC曲線結果表明：miRNA-155、βcatenin mRNA通路聯合測定在CHF患者中的診斷靈敏度、特異度均高于單一miRNA-155、β-catenin mRNA通路的檢測，提示miRNA-155和β-catenin mRNA通路聯合測定在CHF患者中可能獲得較高的診斷效能，或可用于指導臨床診療[4]。Wnt信號傳導途徑由配體蛋白Wnt和膜蛋白受體構成，能激發下游通道的信號轉導途徑，借助細胞表面受體胞內活化，將細胞外的信號傳遞到細胞內[13]。目前，臨床上Wnt信號途徑具有細胞間交流和自體細胞交流兩種形式，其在遺傳學上高度保守，且不同的動物之間也較為相似[6]。而β-catenin是Wnt信號的重要組成部分，能在靜止細胞中與E-Cadherin胞內部分相互結合，從而穩定細胞間黏附[14]。同時，在Wnt信號激活的細胞中從胞漿進入細胞核成為轉錄激活因子[5]。本研究結果發現，βcatenin mRNA通路在正常人體中處于一種動態平衡狀態；但是對于CHF患者，持續的應激反應將會下調βcatenin mRNA通路，直接參與疾病的進展。進一步分析CHF患者miRNA-155與β-catenin mRNA通路的關系發現，CHF患者miRNA-155與β-catenin mRNA通路表達水平呈負相關，說明CHF患者miRNA-155與β-catenin mRNA通路存在緊密聯系。因此，我們可以推斷臨床上對疑似CHF患者可進行miRNA-155表達水平測定，從而提高CHF的早期診斷率；對于確診的心力衰竭患者應及時采取有效的治療措施，且在治療過程中也可對患者進行miRNA-155表達水平的測定，從而更科學地對患者預后進行評估，使得對患者的治療更具科學性。

綜上所述，miRNA-155在CHF患者中呈高表達，且與β-catenin mRNA通路存在顯著的相關性，兩者聯合測定能獲得較高的診斷效能，值得臨床推廣應用。