下調lncRNA SNHG3表達對人胃癌細胞增殖、侵襲、凋亡的影響及機制

谷建斌 張景承 薛菲 耿蘊峰 王冬冬

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，盡管診斷技術在不斷提高，以手術治療為主的綜合治療（包括化療、靶向治療等）也越來越豐富，但胃癌患者的病死率仍位居腫瘤相關死亡的第3位[1]。為了提高胃癌患者的生存期，探索胃癌發生、發展的分子機制，尋找可靠的生物標志物作早期診斷依據和可靠的治療靶點顯得尤為迫切，因此在基因組中大量轉錄的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）成為胃癌研究的新熱點。lncRNA指長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，近年來研究結果發現，在惡性腫瘤組織和正常組織中存在差異表達的lncRNA[2-3]，在多種腫瘤如胃癌、結腸癌、肝癌的發生、發展、轉移以及復發過程中的重要作用也得到了證實[4-6]。核仁小分子RNA宿主基因3（SNHG3）是一種位于1p35.3的lncRNA。研究發現lncRNA SNHG3在胃腺癌組織中異常高表達[7]，但目前關于lncRNA SNHG3在胃癌中發揮的作用及機制研究較少。因此，本研究主要探討下調lncRNA SNHG3的表達對人胃癌細胞增殖、侵襲、凋亡的影響及可能的機制，為胃癌的診斷和治療提供新的方向。

1 材料和方法

1.1 細胞株 人胃癌細胞株SGC-7901、正常胃黏膜上皮GES1均為河北醫科大學第四醫院科研中心惠贈；人胃癌細胞MGC-803購自中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心；人胃腺癌細胞BGC-823購自上海賽百慷生物技術股份有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 SNHG3-siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。lncRNA SNHG3、β-Actin引物使用primer 5軟件設計，由上海生工公司合成。M-MLV反轉錄試劑盒購自美國promega公司；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自北京全式金公司；Lipofectamin2000購自美國 Invitrogen 公司；goat anti rabbit IgG（H+L）、辣根過氧化物酶購自美國Jackson公司；Western blot增強化學發光試劑（ECL）購自美國Millipore公司。Roter gene 3000購自澳大利亞Corbett公司；NanoDrop ND-2000分光光度計購自美國NanoDrop公司；Transwell小室購自美國Corning公司；BD Accuri C6流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 將人胃癌細胞BGC-823、SGC-7901、MGC-803及正常胃黏膜上皮細胞GES1均接種于RPMI 1640培養基，于37℃、5% CO2培養箱中培養，48 h后消化傳代。

1.3.2 lncRNA SNHG3相對表達量檢測 采用qRTPCR法。取對數生長期胃癌細胞BGC-823、SGC-7901、MGC-803及正常胃黏膜上皮細胞GES1，采用 qRTPCR試劑盒檢測lncRNA SNHG3的相對表達量。lncRNA SNHG3 引物：上游：5′AGACA GATTCGCAGTGGTCG3′，下游：5′GTCTCCATGGCCCACTTCTG3′；β-Actin 上游引物 5′-CACCCCAGCCATGTACGTTG-3′，下游引物 5′-AATGTCACGCACGATTTCCC-3′。采用2－ΔΔCt表示胃癌細胞 lncRNA SNHG3 相對表達量。

1.3.3 細胞分組及轉染 將對數生長期的人胃癌細胞BGC-823隨機分為SNHG3-siRNA組、陰性對照組和空白對照組，每組設3個復孔。各組常規培養24 h，SNHG3-siRNA組加入lncRNA SNHG3-siRNA（正義鏈:5′-GCAUUUAGCUAGGAAUGCATT-3′，反義鏈：5′-UGCAUUCCUAGCUAAAUGCTT-3′）轉染，陰性對照組加入無關序列 NC-siRNA（正義鏈：5′-ACUGCGACUGCUUCACUUGTT-3′，反義鏈：5′-CAAGUGAAGCAGUCGCAGUTT-3′）轉染，空白對照組不予轉染。所有操作嚴格按Lipofectamine 2000說明書進行。轉染24 h，提取細胞總RNA，NanoDrop 2000分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測，提取的總RNA純度和完整性符合實驗要求。按照M-MLV反轉錄試劑盒說明書方法逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。根據SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明配制反應體系20 μl。反應條件:95℃預變性 30 s，95℃ 變性10 s，60℃退火 10 s，72℃延伸20 s共40個循環。

1.3.4 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將轉染24 h的3組細胞消化制成單細胞懸液，以5×103個/孔種植于 96孔板（100 μl/孔），在培養 24 h時每孔加入CCK-8 溶液 10 μl，繼續培養 1 h，在 450 nm 波長下，用酶標儀測定各孔光密度（OD）值。

1.3.5 細胞克隆形成能力檢測 克隆形成實驗：將細胞接種于 6孔板（1.5×104個/孔），置于培養箱中培養 1～2周，觀察克隆細胞形成至合適大小時用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，4%多聚甲醛固定15 min，加適量0.1%結晶紫染色液染色10 min，倒置顯微鏡下觀察5個視野，計數細胞的克隆數。克隆形成率（%）=（克隆數目/接種細胞數）×100%。

1.3.6 細胞遷移能力檢測 采用Transwell小室試驗。取各組細胞，均計數5×104個細胞加入 Transwell小室上室中，用無血清培養液正常培養，小室下加入含10%血清的DMEM培養液。培養48 h，將小室取出用PBS沖洗，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染液染色20 min。顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取5個視野計數穿膜細胞數，每組設3個復孔，取平均值。

1.3.7 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell小室試驗。Transwell小室上室用50 μl Matrigel膠包被，在37℃中放置3～5 h。各組分別取200 μl（密度為2.5×105個/ml）細胞接種于Transwell小室上室，在下室加入DMEM培養基。培養48 h后擦去上室的Matrigel膠和多余細胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色，隨機選取5個視野計數穿膜細胞數，每組設3個復孔，取平均值。

1.3.8 細胞各周期百分比及凋亡率檢測 采用流式細胞術（FCM）進行細胞周期分析，通過標準胰蛋白酶消化程序收獲生長對數期的轉染和對照細胞，用PBS洗滌，加入500 μl PI染液和5 μl破膜劑，室溫避光孵育30 min，收集培養物并使用BD Accuri C6流式細胞儀分析細胞周期。數據表示為在細胞周期的G1、S和G2期細胞的百分比分布。按照細胞凋亡檢測試劑盒說明，將細胞每管加入 5 μl Annexin V-FITC 和 10 μl 20 μg/ml碘化丙啶溶液，室溫避光孵育15 min，使用流式細胞儀測定并獲取凋亡比例數據。

1.3.9 信號傳導與活化轉錄因子3（STAT3）、p-STAT3和基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）蛋白的表達水平檢測 采用Western blot法。使用RIPA緩沖液提取總細胞裂解物，通過配置12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS．PAGE，恒壓80 V，2 h）分離蛋白質，并轉移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉，并在4℃下與一抗孵育過夜。緩沖液洗膜（15 min×3次），將膜與二抗孵育，最后用ECL底物試劑盒檢測，實驗重復3次。采用Bio-Rad Image Lab 5.2.1軟件進行灰度分析。

1.4 統計學處理 采用SAS 9.1統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA SNHG3在人胃癌細胞與胃正常黏膜上皮細胞GES1中相對表達量的比較 qRT-PCR結果顯示，與胃正常黏膜上皮細胞GES1相比，BGC-823、MGC-803細胞的lncRNA SNHG3相對表達量均明顯增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。選取lncRNA SNHG3相對表達量最高的胃癌BGC-823細胞系進行下一步的細胞功能試驗。BGC-823細胞中，SNHG3-siRNA組lncRNA SNHG3相對表達量均明顯低于陰性對照組、空白對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表1 lncRNA SNHG3在人胃癌細胞與胃正常黏膜上皮細胞GES1中相對表達量的比較

表2 3組BGC-823細胞中lncRNA SNHG3相對表達量比較

2.2 3組BGC-823細胞增殖能力比較 結果顯示SNHG3-siRNA組的OD值均明顯低于陰性對照組、空白對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3。

2.3 3組BGC-823細胞克隆形成率比較 SNHG3-siRNA組、陰性對照組、空白對照組細胞的克隆形成實驗結果見圖1（插頁）。SNHG3-siRNA組克隆形成率均明顯低于陰性對照組、空白對照組，差異均有統計學意義（均 P＜0.05），見表 4。

圖1 3組細胞克隆形成能力的比較

2.4 3組BGC-823細胞遷移和侵襲能力比較 在Tran－swell遷移實驗中，SNHG3-siRNA組細胞遷移數均明顯低于陰性對照組、空白對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；Transwell侵襲實驗中，SNHG3-siRNA 組細胞侵襲數均明顯低于陰性對照組、空白對照組，差異均有統計學意義（均 P＜0.05），見圖 2（插頁）、表 5。

表3 3組BGC-823細胞增殖能力比較

表4 3組BGC-823細胞克隆形成率比較（%）

圖2 3組BGC-823細胞的遷移、侵襲能力的比較（a：遷移實驗；b：侵襲實驗；結晶紫染色，×200）

2.5 3組BGC-823細胞各周期細胞百分比和凋亡率比較 BGC-823細胞轉染SNHG3 siRNA 24 h后，SNHG3-siRNA組細胞G1期百分比均明顯高于空白對照組、陰性對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），3組細胞S期百分比比較差異則無統計學意義（P＞0.05）；SNHG3-siRNA組細胞G2期百分比均明顯低于空白對照組、陰性對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖3、表6。下調lncRNA SNHG3的表達后，SNHG3-siRNA組細胞凋亡率均明顯高于空白對照組、陰性對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖4。

表5 3組BGC-823細胞遷移、侵襲數比較（個/視野）

2.6 3組BGC-823細胞STAT3、p-STAT3和MMP-2蛋白表達水平比較 Western blot結果顯示，與陰性對照組和空白對照組比較，SNHG3-siRNA組的STAT3、p-STAT3和 MMP-2蛋白的表達水平均明顯下降，p-STAT3/STAT3的比值明顯降低，差異均有統計學意義（均 P＜0.05），見圖 5、表 7。

圖3 3組BGC-823細胞各周期細胞百分比的比較

圖4 3組BGC-823細胞凋亡情況的比較

表6 3組BGC-823細胞各周期細胞百分比的比較（%）

圖5 3組BGC-823細胞STAT3、p-STAT3、MMP-2蛋白表達水平的比較（STAT3為信號傳導與活化轉錄因子3；MMP-2為基質金屬蛋白酶-2）

表7 3組 BGC-823細胞 STAT3、p-STAT3、MMP-2蛋白表達水平的比較

3 討論

目前大量研究表明，lncRNA在腫瘤的發生、發展中起到重要的調控作用[8-9]。lncRNA SNHG3作為一種lncRNA，最初由Pelczar等[9]發現。近期研究發現，lncRNA SNHG3在肝癌、結直腸癌中均表達增高[10-11]，是肝癌、結直腸癌不良預后的重要指標。Huang等[11]發現，在結直腸癌中，SNHG3作為內源性競爭性RNA與miR-182-5p相互競爭，導致c-Myc過表達并作用于c-Myc的目的基因，從而促進了結直腸癌進展。而在胃癌的研究中，lncRNA SNHG3在胃癌組織中高表達[7]，并且高表達的胃癌患者的生存時間顯著低于低表達的胃癌患者[12]。為了進一步探討lncRNA SNHG3在胃癌中發揮的作用及機制，本研究以胃癌細胞為研究對象，qRT-PCR結果顯示，胃癌細胞BGC-823、MGC-803中lncRNA SNHG3的相對表達量均明顯高于胃正常黏膜上皮細胞系GES1，提示lncRNA SNHG3高表達與胃癌的發生相關。

應用siRNA技術轉染BGC-823下調lncRNA SNHG3表達后，CCK-8實驗和克隆形成實驗結果顯示細胞增殖能力、克隆形成能力均受到顯著抑制，提示lncRNA SNHG3在胃癌發展及克隆性增殖過程中發揮了一定作用。進一步研究發現，下調lncRNA SNHG3表達后，G1期細胞百分比上升，G2期細胞百分比下降，提示下調lncRNA SNHG3的表達，使細胞周期阻滯于G1期，抑制胃癌細胞BGC-823進入G2期，從而抑制胃癌細胞BGC-823的分裂增殖。下調lncRNA SNHG3的表達后，BGC-823細胞凋亡率顯著上升，這些結果表明lncRNA SNHG3下調所引起的分裂增殖抑制、凋亡增加可能是胃癌細胞增殖能力下降的部分原因。Transwell遷移、侵襲實驗表明，胃癌細胞BGC-823在lncRNA SNHG3下調后的遷移及侵襲能力均顯著降低，說明在侵襲和轉移的過程中lncRNA SNHG3可能也扮演了重要的角色。

信號傳導與活化轉錄因子（signal transducer andactivator of transcription，STATs）家族成員具有信號轉導和轉錄調控雙重功能[13]。酪氨酸激酶相關受體、STATs、JAK酪氨酸激酶（Janus kinase）構成了JAK-STAT信號通路。生理狀態下，JAK-STAT通路的激活快速而短暫，而在人類腫瘤細胞中該通路則持續激活[14]，JAK-STAT信號的異常激活可促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲及上皮間質轉化[15]。STAT3作為IL-6R、表皮生長因子受體、JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號通路的會聚點，其持續性激活能上調 Bcl-xl、Mcl-1、CyclinsD1/D2、C-myc 和survivin基因的表達，下調p53基因的表達，縮短細胞在G1期的停滯時間，使其快速進入S期，干擾正常細胞的增殖、分化、凋亡[16]。磷酸化后的STAT3是STAT3的活性形式，其形成二聚體后進入細胞核內調控相關基因的轉錄[17]，誘導多種參與細胞存活、增殖、遷移、侵襲、血管生成及免疫逃逸等基因的表達，促進致癌性轉化。抑制STAT3磷酸化及p-STAT3介導的DNA轉錄和復制，可促進腫瘤細胞凋亡[18]。近期研究發現，p-STAT3蛋白與胃癌患者不良預后及胃癌分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移及腫瘤浸潤深度密切相關，提示其對胃癌的發展起調控作用，可能作為預測胃癌的一個分子標志物[19]。本研究中，下調lncRNA SNHG3表達后，STAT3、p-STAT3的表達水平顯著下降。p-STAT3/STAT3的比值顯著降低，細胞周期阻滯于G1期，細胞凋亡比例顯著上升，提示lncRNA SNHG3表達下調，可能與抑制STAT3的表達和STAT3的磷酸化水平有關，進而抑制了BGC-823細胞增殖，誘導了凋亡。MMP-2是MMPs家族中的重要一員，其能夠降解細胞基底膜及細胞外基質成分Ⅳ型膠原，從而促進腫瘤侵襲和轉移。研究發現，STAT3可通過MMP-2啟動子上的結合位點，上調MMP-2基因表達水平，進而顯著提高胃癌細胞的轉移能力[20]。阻斷STAT3能明顯下調MMP-2蛋白的表達水平，抑制腫瘤細胞的生長和侵襲。本研究中，在下調lncRNA SNHG3表達后，STAT3、p-STAT3、MMP2 的表達水平均顯著下降，BGC-823細胞遷移及侵襲能力均顯著降低，提示可能與抑制MMP-2的表達從而抑制了BGC-823細胞的侵襲有關。這在一定程度上解釋了下調lncRNA SNHG3后細胞增殖、克隆、Transwell侵襲實驗和細胞凋亡實驗的結果，抑制lncRNA SNHG3基因有望應用于胃癌的靶向治療。

綜上所述，本研究從細胞水平證實了lncRNA SNHG3在胃癌細胞中高表達，同時其是胃癌細胞增殖、抗凋亡、侵襲以及轉移的必要因素，對其進行干擾可以有效破壞胃癌細胞的這些生物學行為，這可能與抑制STAT3、MMP-2的表達和STAT3的磷酸化水平有關。下調lncRNA SNHG3 表達后，調控 STAT3、p-STAT3、MMP-2 表達水平的具體分子機制尚待進一步研究。