抑制miR-93-5p表達對人卵巢癌細胞增殖和遷移的影響

趙靈琴 于愛軍 劉文洪 高雯 方晨燕 張平

卵巢癌是常見的女性惡性腫瘤之一，其發病率僅次于宮頸癌及子宮內膜癌，位居第3，而其病死率則高居婦科腫瘤之首[1]，約有45%～60%的病理確診的患者最終將死于卵巢癌[2-3]。目前卵巢癌的治療主要以手術切除為主，術后化療為輔，從而提高患者的臨床緩解率及延長中位生存時間，但由于化療耐藥的存在影響治療療效，腫瘤復發和轉移也是影響患者預后的關鍵因素[4-5]。盡管卵巢癌治療在現代技術的發展中已經取得了諸多成就，但卵巢癌背后的分子機制仍是癌癥研究領域的焦點。

miRNA生物學效應廣泛，對個體發育、細胞分化、增殖和凋亡等生理活動均起重要調控作用[6]。研究表明，超過50%的編碼基因位于與腫瘤相關的基因位點，這說明miRNA可能在腫瘤的發生、發展中扮演重要角色[7]。基因變異導致相關功能因子表達紊亂在卵巢癌的發生、發展中的作用相關研究是目前腫瘤研究熱點[8]。有研究指出在肝癌[9]及胃癌[10]中miR-93作為癌基因直接靶向程序性細胞死亡因子4從而促進癌癥的形成。然而，miR-93-5p在卵巢癌當中的作用及機制卻少有報道。本研究旨在探討miR-93-5p對卵巢癌細胞增殖和轉移的影響，并初步探究可能的下游調控機制。

1 材料和方法

1.1 細胞 正常卵巢上皮細胞（IOSE80）與卵巢癌細胞（SKOV3、A2780、ES2）均購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 試劑 DMEM/F-12（1∶1）、FBS均購自美國Hyclone公司；青霉素-鏈霉素購自杭州吉諾生物醫藥技術有限公司；四甲基亞唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購自上海碧云天公司；Trizol、反轉錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit和SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Kit均購自日本Takara公司；miR-93-5p抑制物（miR-93-5p inhibitor）、空載體陰性對照物、miR-93-5p模擬物（miR-93-5p imimics）、對照物（miR-NC）、轉染試劑 Lipofectamine 2000 Transfection均購自山東維真生物科技有限公司；一抗（RBM24、GAPDH）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗均購自美國CST公司；ECL顯影液購自美國Bio-Rad公司。

1.3 儀器 3110型二氧化碳培養箱購自美國Thermo公司；Ti-U型熒光倒置顯微鏡購自日本尼康公司；ME155DU型電子天平購自瑞士梅特勒公司；GT10-2型臺式離心機購自北京金洋萬達科技有限公司；J-HH-6A型恒溫水浴箱購自上海梓桂儀器有限公司；MDFU3386S型超低溫冰箱購自日本Sanyo公司；TS-1型轉移脫色搖床購自上海亞榮生化儀器廠；1658001型電泳儀購自美國Bio-Rad公司；JS-1070Mini化學發光成像系統購自上海培清科技有限公司；Synergy2型多功能酶標儀購自美國BioTek公司；7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.4 細胞培養 正常卵巢上皮細胞（IOSE80）與卵巢癌細胞（SKOV3、A2780、ES2）培養于含 10% FBS、青霉素200 U/ml、鏈霉素200 U/ml的DMEM完全培養液中，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。每2 d換液1次，待細胞達到80%～90%融合度后，經胰蛋白酶消化，按1∶3傳代，置于37℃、5% CO2培養箱內繼續培養，取對數期細胞用于實驗。

1.5 miR-93-5p相對表達量檢測 采用qRT-PCR法。使用 Trizol試劑從 IOSE80、SKOV3、A2780、ES2 細胞株中提取總RNA。按照反轉錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit和 SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Ki試劑盒進行逆轉錄和qRT-PCR。miR-93-5p上游引物序列：5′-AGCAGTAGGTTGGGTAATC-3′，下游引物序列：5′-GCTGTTCGTGCAGGTAGT-3′。miR-93-5p 以 U6 為內參，U6 上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR 反應條件：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；（95 ℃，30 s；60 ℃，1 min）×40；60 ℃，5 min。

1.6 基因轉染 將miR-93-5p inhibitor和空載體陰性對照物干粉用RNase-free水配制成20 μmol/L的母液后分裝、凍存備用。將SKOV3細胞分成inhibitor組和陰性對照組（NC組），兩組細胞消化后鋪在6 cm的培養皿中，過夜至細胞密度達70%左右。棄去培養基后加入無血清MEM培養基，按照Lipofectamine 2000 Transfection試劑盒說明書要求進行轉染，其中inhibitor組轉染miR-93-5p inhibitor，NC組轉染陰性對照物。孵育6～8 h后，棄去原培養基，換成完全培養基后繼續培養48 h。

1.7 細胞相對存活率檢測 采用MTT法。收集對數期inhibitor組和NC組細胞，調整細胞密度為3 000個/孔，每個實驗組設置4個復孔，每孔100 μl加入到96孔板，置37℃含有5% CO2培養箱培養。細胞經轉染后，繼續培養 12、24、48、72 h，每孔加入 20 μl濃度為 5 mg/ml的MTT溶液，培養箱中繼續孵育4 h，棄去上清液，每孔加入100 μl DMSO后震蕩10 min，用酶標儀在570 nm處測定吸光度（OD值）。重復實驗3次，以平均值統計結果，計算各濃度下細胞相對存活率。相對存活率（%）=（各實驗組OD/0 h OD）×100%

1.8 細胞相對遷移率檢測 采用細胞劃痕實驗。取對數期inhibitor組和NC組細胞，接種于6孔板中培養，調整細胞密度為6×105個/孔。于培養箱中培養24 h且單層細胞鋪滿6孔板板底時（細胞融合度約為90%），將滅菌尺固定于孔的正上方中央位置，用裝有200 μl槍頭的移液槍沿著滅菌尺滑動，劃痕橫穿過孔。每孔劃3條長直劃痕，作為每組細胞平行組。小心吸掉培養基，用PBS小心地清洗3遍，洗去劃痕產生的漂浮細胞。然后換上新的培養基。分別于劃痕后0、12、24 h后，用顯微鏡拍照并記錄劃痕愈合程度。然后用Image J軟件分析，并計算細胞相對遷移率。

1.9 RBM24蛋白相對表達量檢測 采用Western blot法。裂解并提取inhibitor組和NC組細胞的蛋白，根據碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行標準曲線的制備，根據標準曲線計算出各個樣品的蛋白含量，調整樣品濃度后進行上樣，經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉印，5%脫脂奶粉封閉，封閉后加入相應一抗4℃搖床過夜，第2天加入相應二抗，室溫孵育2 h后TBST洗膜3次。ECL浸泡后用化學發光熒光成像系統對圖像進行掃描和分析。

1.10 熒光素酶報告基因檢測 收集對數期的SKOV3細胞，將細胞分為對照組（miR-NC組）和過表達組（miR-93-5p mimics組），胰酶消化離心，重懸后調整細胞懸液濃度為1×106個/ml，并接種至6孔板，在細胞融合度約50%時使用LipofectamineTM2000轉染試劑，將miR-NC轉染至miR-NC組，將miR-93-5p mimics轉染至miR-93-5p mimics組，另外將pGL3空白質粒、RBM24 3′-UTR 突變型質粒、RBM24 3′-UTR 野生型質粒共轉染至兩組細胞，常規培養48 h。加入細胞裂解液裂解細胞，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液進行熒光素酶活性檢測。通過比較熒光強度判斷miR-93-5p對RBM24的調控作用。

1.11 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同細胞中miR-93-5p相對表達量比較 miR-93-5p 在卵巢癌細胞（SKOV3、A2780、ES2）中的表達水平均明顯高于正常卵巢上皮細胞（IOSE80），差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。根據此結果，本研究團隊選取miR-93-5p表達量最高的SKOV3細胞株進行后續實驗。

表1 不同細胞中miR-93-5p相對表達量比較

2.2 兩組細胞相對存活率比較 與NC組相比，inhibitor組細胞在48和72 h時的相對存活率均顯著降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組細胞相對存活率比較（與NC組比較，*P＜0.05）

2.3 兩組細胞相對遷移率比較 Inhibitor組細胞在12 h時的相對遷移率為（40.67±4.21）%，在24 h時的相對遷移率為（33.76±3.42）%，與NC組比較差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見圖2和表2。

2.4 兩組細胞RBM24蛋白相對表達量比較 與NC組比較，inhibitor組細胞中RBM24蛋白相對表達量明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3和表3。

2.5 miR-93-5p靶基因預測及驗證 通過TargetScan靶點預測軟件預測到RBM24是miR-93-5p潛在的靶基因，見圖4。熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與miR-NC組比較，miR-93-5p mimics組中RBM24-MUT表達差異無統計學意義（P＞0.05），而RBM24-WT表達則顯著下調，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

3 討論

卵巢癌是臨床上常見的婦科生殖系統惡性腫瘤疾病之一，其發病率位于三大婦科惡性腫瘤之末，但病死率卻高居首位，由于卵巢組織具有解剖部位隱蔽性及內分泌功能復雜性，導致卵巢癌早期癥狀不明顯，不易被發現，嚴重威脅女性的生命健康[11]。因此，尋找有效的卵巢癌分子標志物是當下的研究熱點。

圖3 兩組細胞RBM24蛋白表達的電泳圖

表3 兩組細胞RBM24蛋白相對表達量比較

圖4 TargetScan靶點預測結果

表4 熒光素酶報告基因檢測結果

miRNA是近年來發現的一類長度較短的單鏈非編碼RNA，與靶基因的3′非翻譯區互補結合，能夠通過誘導靶基因mRNA降解或者抑制其翻譯，從而實現對靶基因的調控作用[12]。近幾年研究發現miRNA與惡性腫瘤的發生、發展密切相關，許多miRNA在腫瘤中呈現異常表達。miRNA根據其在癌癥發生中的作用分為兩類：一類為致癌miRNA，另一類為抑癌miRNA。致癌miRNA通過抑制抑癌基因的靶mRNA，發揮其致癌作用，例如miR-448能夠通過下調SPACRL1的表達進而促進口腔鱗癌增殖及遷移的能力[13]；miR-182通過抑制FOXO1的表達，從而促進乳腺癌細胞的侵襲和遷移[14]。而抑癌miRNA通過抑制癌基因的靶mRNA的表達，發揮抑癌作用，例如miR-363能夠通過靶向作用于CTHRC1，進而抑制結直腸癌細胞的增殖和遷移[15]；miR-126通過下調NCoA7的表達，進而抑制ARNT介導的肺鱗癌細胞增殖[16]。miR-93-5p位于染色體11q22.1，屬于miR-106b-25家族。研究發現miR-93-5p在胃癌中表達上調，并能夠通過靶向調控Hippo信號通路從而促進胃癌細胞的增殖和轉移[17]。有研究發現miR-93在結腸癌病灶中表達顯著下調，其表達降低與結腸癌轉移、分化和預后不良密切相關，并且上調miR-93的表達能夠通過抑制Wnt/β-catenin信號通路進而抑制結腸的侵襲和轉移[18]。同時，也有研究顯示miR-93-5p與結直腸癌[19]、食管癌[20]和肺癌[21]的發生、發展密切相關。雖然目前關于miR-93-5p的報道已有很多，但主要集中在胃癌、結直腸癌的研究中。

本研究結果顯示，相對于正常卵巢上皮細胞，miR-93-5p在卵巢癌細胞中顯著高表達，表明miR-93-5p可能參與卵巢癌的發生和發展過程。因此，本研究通過轉染miR-93-5p inhibitor，實現抑制卵巢癌細胞SKOV3中miR-93-5p的相對表達量。MTT結果顯示，轉染miR-93-5p inhibitor的細胞相對存活率受到抑制，同時細胞劃痕實驗結果顯示，轉染miR-93-5p inhibitor的細胞相對遷移率也受到抑制，較NC組均有統計學差異。這表明在卵巢癌的發生、發展過程中，miR-93-5p可能起到促進癌細胞生長和轉移的作用。

卵巢癌的發生和發展受到多種基因和蛋白的調控，而研究關于這些相關基因和蛋白對了解卵巢癌的發病機制具有重要意義。RBM24在肌原性的分化和心臟發育中起著重要的作用。有研究表明，RBM24可以在轉錄水平上調節p21和p63的穩定性[22]。目前已有文獻指出RBM24在乳腺癌中呈現低表達[23]，并且在鼻咽癌中起到抑癌的作用[24]。在本研究中，生物信息學軟件分析表明RBM24是miR-93-5p直接作用的靶基因，熒光素酶報告基因實驗驗證了該結果，并且在卵巢癌細胞SKOV3中抑制miR-93-5p后，RBM24蛋白的表達量顯著升高，進一步說明miR-93-5p能夠抑制卵巢癌細胞中的RBM24的表達量。以上結果均提示，miR-93-5p在卵巢癌細胞中高表達，可以通過負調控靶基因RBM24促進卵巢癌細胞的增殖和轉移。因此，miR-93-5p可能是卵巢癌腫瘤發展過程中的重要因子，可能成為卵巢癌診斷或治療的新靶點。