基于信息熵與響應面設計的冰硼痔瘡栓提取工藝優選

王 玉，李 希，馮建安，黃 嫣，毛 紅，趙 強，施崇精

(四川省中醫藥科學院 中醫研究所，四川 成都 610031)

痔瘡是我國城市居民常見肛腸科疾病之一，近年來隨著飲食結構和生活方式的改變，其發病率逐漸上升[1]，發病人群分布廣泛，任意年齡段均可發病，痔瘡的臨床癥狀有肛周疼痛、肛門腫脹、大便滴血、便干或秘結等[2]，對患者的生活與工作影響極大。冰硼痔瘡栓功能消炎止痛、生肌止血，能夠有效緩解各期痔瘡疼痛和出血，調節微循環，促進毛細血管新生，促進創面修復，臨床療效顯著，且不良反應少[1]。

冰硼痔瘡栓由黃連、黃柏、大黃、地榆、苦參、紫草、冰片、硼砂等15味藥材組成，根據原處方工藝及藥材性質，其中5味藥材采用乙醇提取工藝，分別是黃連、黃柏、大黃、地榆、苦參，黃連和黃柏均具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。現代藥理研究表明[3-8]，鹽酸小檗堿是黃連和黃柏抗炎的主要成分，因此，本研究以鹽酸小檗堿含量為主要指標并結合出膏率評價冰硼痔瘡栓的提取工藝。評價提取工藝的關鍵是工藝設計和對各指標的賦權，本研究采用信息熵賦權與響應面設計結合[9-10]，優選冰硼痔瘡栓提取工藝參數，從而獲得質量穩定均一的浸膏，為制劑的后期研究及工業化生產提供了實驗依據，現將實驗過程報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀(Waters公司)；Waters 2998 PDA檢測器(Waters公司)；BT-125D分析天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；BH-15電子天平(啟東友銘衡器有限公司)；GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；KQ-300DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司)。

1.2 試藥

黃連飲片、黃柏飲片、大黃飲片、地榆飲片、苦參飲片均購于四川省中藥飲片有限責任公司，由四川省中醫藥科學院中醫研究所謝守德主任中藥師鑒定為真品，均符合2015年版《中國藥典》有關規定；鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-201814，含量86.7%)，購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；水為超純水；其余均為分析純。

2 方法與結果

2.1 指標成分的定量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，4 μm)；乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50)(每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g)；檢測波長254 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 取鹽酸小檗堿對照品精密稱定，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為1.12 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取各試驗項下提取液，搖勻，濾過，即得。

2.1.4 陰性溶液制備 按處方比例，取缺黃連飲片和黃柏飲片的其余藥材，按供試品溶液制備方法，制備陰性溶液。

2.1.5 專屬性試驗 分別取以上對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液，按照上述色譜條件測定，結果表明，指標成分色譜峰分離度好，陰性無干擾。色譜見圖1。

注：A：對照品溶液色譜；B：供試品溶液色譜；C：陰性溶液色譜

2.1.6 線性與范圍試驗 分別精密量取“2.1.2”項下對照品溶液1、2、3、4、5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為0.112、0.224、0.336、0.448、0.560、1.12 mg/mL的對照品溶液，按照上述色譜條件測定，以濃度(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程：Y=40000000X+449157(r=0.999 6)，表明鹽酸小檗堿在0.112～1.12 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.7 精密度試驗 取同一份對照品溶液，連續進樣6次，進行測定。結果鹽酸小檗堿峰面積的RSD為1.31%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復性試驗 平行制備6份供試品溶液，進行測定。結果鹽酸小檗堿峰面積的RSD為2.53%，表明該方法的重復性良好。

2.1.9 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h進行測定。結果鹽酸小檗堿峰面積的RSD為1.80%，表明該供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.10 加樣回收試驗 精密量取已知含量的供試品溶液6份，取鹽酸小檗堿對照品適量，按1∶1的比例加入，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進行測定，計算回收率。結果鹽酸小檗堿的回收率為98.47%，RSD為3.34%，表明該方法準確度良好。

2.2 干膏得率測定

精密移取提取液20 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥至恒重，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計算干膏得率。

2.3 Box-Behnken試驗設計及結果

2.3.1 單因素試驗 以鹽酸小檗堿含量和干膏得率為指標，分別考察影響乙醇提取工藝的關鍵影響因素乙醇濃度、加乙醇量、提取時間、提取次數，確定響應面試驗影響因素的水平。

乙醇濃度的影響：按處方比例稱取藥材，分別加入乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液8倍量，加熱回流提取2次，每次1h，過濾，濾液進行含量測定和干膏得率測定(圖2)，確定響應面考察乙醇濃度影響因素的范圍為60%～80%。

圖2 乙醇濃度影響因素試驗結果

加乙醇量的影響：按處方比例稱取藥材，分別加入乙醇濃度為70%的乙醇溶液6、8、10、12倍量，加熱回流提取2次，每次1 h，過濾，濾液進行含量測定和干膏得率測定(圖3)，確定響應面考察加乙醇量6～10倍。

圖3 加乙醇量影響因素試驗結果

提取時間的影響：按處方比例稱取藥材，加入乙醇濃度為70%的乙醇溶液8倍量，加熱回流提取2次，每次分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，過濾，濾液進行含量測定和干膏得率測定(圖4)，確定響應面考察提取時間影響因素的范圍為1.0～2.0 h。

圖4 提取時間影響因素試驗結果

提取次數的影響：按處方比例稱取藥材，加入乙醇濃度為70%的乙醇溶液8倍量，分別加熱回流提取1、2、3次，每次1 h，過濾，濾液進行含量測定和干膏得率測定(圖5)。由圖5可知，提取次數2次為最優，因此固定提取次數2次。

圖5 提取次數影響因素試驗結果

2.3.2 響應面實驗設計 根據單因素試驗結果，采用Design-Expert 8.0軟件設計冰硼痔瘡栓提取工藝因素水平表，以綜合評分為指標[11-12]，由信息熵賦權得到組合權重(表1)，按提取工藝試驗設計及結果進行試驗(表2)，方差分析見表3。

表1 提取工藝權重

表2 提取工藝試驗設計及結果

表3 提取工藝方差分析結果

2.3.3 信息熵賦權 參照文獻[11-16]，首先列出原始評價矩陣(X)；再將其轉換成“概率”矩陣(P)，如下。

根據公式，計算各項指標的Hi，如下。

Hi=(0.9952 0.9977)

根據公式，計算各評價指標的權重系數，如下。

Wi=(0.6816 0.3184)

即原始矩陣加權處理綜合指標=X/Xmax×0.06816+Y/Ymax×0.03184。

得到回歸方程為：R=0.99+0.075A+0.03C-0.16A2-0.034B2-0.039C2，r=0.980 3表明模型預測性良好，由方差分析可知該模型P<0.000 1，說明該模型具有極顯著性。影響因素乙醇濃度P<0.000 1，表明該因素具有極顯著性；影響因素提取時間P>0.05，表明該因素不具有顯著性；影響因素加乙醇量P<0.05，表明該因素具有顯著性。綜合分析可知，影響因素的順序為：乙醇濃度>提取時間>加乙醇量，等高線圖和三維曲面圖(圖6)，綜合以上，優選的最佳提取工藝參數修正為：乙醇濃度70%，加乙醇量8倍，提取次數2次，提取時間1 h。

圖6 各交互因素等高線和三維曲面

2.4 驗證試驗

根據以上優選的最佳提取工藝參數，按處方量稱取藥材飲片，加8倍量70%乙醇，提取次數2次，每次1 h，過濾，濾液按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按含量測定方法測定含量，按干膏得率測定方法測定干膏得率，計算鹽酸小檗堿含量RSD為0.93%，計算干膏得率RSD為2.02%。表明該工藝穩定可靠。

3 討論

痔瘡是我國醫學最早發現的疾病之一，關于痔的描述最早見于《山海經·西山經》：“有鳥，名曰棟，食之已痔。”最早記載有關痔瘡分類和證候的是《五十二病方》，痔瘡的中醫療法主要有清熱、涼血、解毒等[17-18]，冰硼痔瘡栓能消炎止痛、生肌止血，能夠有效緩解各期痔瘡疼痛和出血，從根本入手，改善機體的整體狀況，且栓劑在肛腸中應用很廣，適合臨床應用。

黃連性寒味苦，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，可用于治療濕疹、濕瘡等[19]。現代研究表明，其主要活性成分小檗堿、黃連堿、巴馬亭和藥根堿占總活性堿的95%，小檗堿含量在 50%以上，是其主要抑菌成分[20]。黃柏性寒味苦，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，用于瘡瘍腫毒、濕疹濕瘡等，也含有小檗堿成分[21]。本研究以鹽酸小檗堿含量測定為評價指標，同時測定黃連和黃柏的有效成分，并結合信息熵賦權和響應面設計，科學合理地優選冰硼痔瘡栓提取工藝，為制劑的后期研究及工業化生產提供實驗依據。