黃精地龍配伍對自然衰老小鼠學習記憶及海馬神經凋亡的影響

錢紅月，肖移生，侯吉華，姜劼琳

(江西中醫藥大學 中醫學院，江西 南昌 330004)

機體進入老齡，記憶力會有不同程度的衰減，嚴重者可出現癡呆，記憶認識障礙是危害老年人健康的重要因素[1]。當前，人口老齡化已成為全球性社會問題，研發抗衰老、抗癡呆藥物用于改善老年人記憶、認知功能已成為國際醫藥界研究的熱點[2]。黃精地龍配伍為筆者團隊中藥配伍復方的重要成果之一，該配伍可改善造模性癡呆大、小鼠學習記憶功能，增加腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，減少丙二醛(MDA)含量，顯示出良好的抗氧化、抗炎、降低神經中樞氧化應激水平的作用[3]，并可調控中樞神經膽堿能遞質系統發揮抗癡呆作用[4-6]，且該配伍對體外培養分化的SH-SY5Y神經細胞Aβ25-35損傷具有良好的保護作用，促進SH-SY5Y神經細胞增殖，這與其具有抗氧化損傷、調控細胞內鈣穩態等機制有關[7-8]。這些研究顯示出黃精地龍配伍具有較好的神經保護作用。由此，可以推測該配伍也具有改善自然老齡動物學習記憶的功能。本課題擬觀察黃精地龍配伍對自然老齡小鼠學習記憶及海馬神經凋亡的影響，驗證該配伍神經保護作用的可重復性及穩定性，并為其臨床轉化提供有價值的實驗依據。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物與分組

40只SPF級、雄性、18月齡昆明小鼠(自然老齡小鼠，體質量(38±4)g)進入實驗室后，適應性飼養1周，再隨機分成老齡組、黃精地龍低、中、高劑量組(分別為2、4、8 g·kg-1·d-1劑量[3])，每組10只老齡小鼠；另有10只SPF級、雄性、2月齡昆明小鼠(體質量(22±2)g)設為青年對照組。所有動物由江西中醫藥大學實驗動物中心提供(許可證編號：SYXK(贛)2017-0004)。本課題動物實驗方案已由江西中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查通過(批準編號：20191025186)，研究中動物處置全過程嚴格遵守實驗動物倫理學相關條例。

1.2 試驗藥物與試劑

黃精地龍配伍由酒黃精、炙地龍兩味中藥按質量1∶1組成，兩味中藥均購自江西中醫藥大學附屬醫院門診中藥房，經鑒定屬合格品，符合國家中藥臨床應用標準；焦油紫為Solarbio公司產品；Bcl-2及Caspase-3兔抗小鼠一抗均為美國Invitrogen公司的產品；免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均為北京中杉金橋公司產品。

1.3 儀器

EX-TE-03小型中藥提取罐(上海順儀實驗設備公司)，STRIKE 300型旋轉蒸發儀(德國ChemTron公司)，DT-200型小鼠跳臺儀(上海康為醫療公司)，BW100型曠場實驗箱(荷蘭Noldus公司)，BX-41型顯微數碼系統(日本Olympus公司)，Motic Image Advanced3.2圖像數據分析軟件(德國Motic公司)。

2 方法

2.1 試驗藥液提取制備

按本課題組成熟的方法提取黃精地龍配伍藥液[3-7]，即稱取黃精、地龍各200 g，混合后粉碎，加10倍量的蒸餾水充分浸泡，加熱后沸水回流1 h，濾過，收集藥液；向藥渣內再加3倍量蒸餾水，并再次沸水回流30 min，濾過，收集藥液；合并兩次提取藥液后進行離心；取上清藥液再濃縮成200 mL藥液(每1 mL相當于含生藥1 g)。

2.2 實驗動物干預

黃精地龍低、中、高劑量組各小鼠分別灌胃2、4、8 g·kg-1·d-1黃精地龍濃縮提取液，老齡組各小鼠灌胃0.5 mL·d-1生理鹽水。以上各組小鼠連續灌胃干預4周，4周后進行各指標檢測。青年對照組小鼠無特殊干預，僅日常飼養。

2.3 跳臺試驗

參考本課題組常用的跳臺試驗方法進行[3-4]。即實驗分訓練和測驗兩部分進行，訓練時先將小鼠放入反應箱內適應3 min，然后立即通以36 V交流電，動物受到電擊后跳上平臺以躲避電擊為正確反應，如再次跳到銅柵上受到電擊，即為錯誤反應。如此訓練5 min，由系統自動記錄每只小鼠受電擊后跳上平臺的反應時間及跳下平臺受電擊的錯誤反應次數，作為學習成績。24 h后再做測驗，測驗時將小鼠平穩放在跳臺上，記錄第一次跳下平臺的潛伏期和5 min內錯誤反應次數，作為動物的記憶保持能力。若5 min內小鼠未跳下平臺，潛伏期按300 s計算。

2.4 曠場試驗

曠場實驗箱為一長、寬、高為55 cm×55 cm×30 cm的裝置，正上方2 m處有紅外攝像頭，視野可覆蓋整個曠場，底面被平均分成25個小格，中間9個小格為中央區，其余16個小格則為周圍區。實驗開始時，將小鼠置于曠場的正中央，讓其自由探索10 min，由系統自動記錄并進行分析，計算小鼠在中央區的活動時間以及10 min內的活動總路程，重復檢測3次。本實驗需在安靜、回避人的實驗室內進行，且每只小鼠實驗結束后，均需用酒精擦拭曠場，以消除氣味對實驗結果的干擾。

2.5 取材

完成曠場實驗后次日，深度麻醉小鼠后由心臟左心室內灌注4%多聚甲醛固定，再取出大腦置于4%多聚甲醛再固定48 h(4 ℃)，進行常規石蠟包埋，行冠狀位連續切片，用于海馬尼氏染色及免疫組化染色。

2.6 尼氏染色

海馬切片晾干后置于0.1%的焦油紫溶液中37 ℃染色5 min，蒸餾水沖洗；95%酒精分化，蒸餾水沖洗；梯度酒精(70%→80%→90%→95%I→95% II→100% I→100%II)各3 min脫水，二甲苯I、二甲苯II透明各3 min，中性樹膠封片；光鏡下觀察各組小鼠海馬CA1、CA3區神經元形態學、數量等的變化。神經元計數方法：于10×40倍光鏡下，每一腦片隨機選取相鄰3個視野，鏡下面積為4.5×10-2mm2，運用 Motic 數據分析軟件計數神經元，結果取平均值。

2.7 免疫組化染色

免疫組化染色步驟按試劑盒推薦的SP法操作，使用的一抗有Bcl-2及Caspase-3抗體(1∶500)。同尼氏染色的神經元觀察與計數方法，光鏡下觀察各組小鼠海馬CA1、CA3區免疫陽性神經元并計數。

2.8 統計方法

3 結果

3.1 各組小鼠跳臺試驗的學習和記憶成績比較

與青年對照組比較，老齡組小鼠學習反應時間明顯延長，記憶潛伏時間明顯縮短，學習與記憶成績的錯誤次數明顯增多(P<0.01)；與老齡組比較，黃精地龍低、中、高劑量組小鼠學習反應時間縮短，記憶潛伏時間延長，學習與記憶成績的錯誤次數減少(P<0.05，P<0.01)，且隨藥物劑量增加，效果越明顯(量效關系明顯)。見表1。

表1 各組小鼠跳臺試驗的學習和記憶成績比較

3.2 各組小鼠曠場試驗的中央區活動時間和活動總路程的比較

與青年對照組比較，老齡組小鼠中央區活動時間及活動總路程均明顯縮短(P<0.01)；與老齡組比較，黃精地龍低、中、高劑量組小鼠的中央區活動時間及活動總路程均明顯變長(P<0.05，P<0.01)，且量效關系明顯。見表2。

表2 各組小鼠曠場試驗的中央區活動時間和活動總路程的比較

3.3 各組小鼠海馬尼氏染色CA1、CA3區神經元數量比較

與青年對照組比較，老齡組小鼠海馬CA1、CA3區神經元數量均明顯減少(P<0.01)；與老齡組比較，黃精地龍低、中、高劑量組小鼠海馬CA1、CA3區神經元數量均明顯增多(P<0.05，P<0.01)，且量效關系明顯。見表3。

表3 各組小鼠海馬尼氏染色CA1、CA3區神經元數量比較

3.4 各組小鼠海馬CA1及CA3區的Bcl-2、Caspase-3陽性神經元數量比較

與青年對照組比較，老齡組小鼠海馬CA1與CA3區的Bcl-2免疫陽性神經元數量明顯降低、Caspase-3免疫陽性神經元數量明顯升高(P<0.01)；與老齡組比較，黃精地龍低、中、高劑量組小鼠海馬CA1與CA3區的Bcl-2免疫陽性神經元數量明顯升高、Caspase-3免疫陽性神經元數量明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且量效關系明顯。見表4。

表4 各組小鼠海馬CA1及CA3區的Bcl-2、Caspase-3陽性神經元數量比較

4 討論

衰老是生命后期階段進行的全身性、多方面、復雜的退化過程，涉及全身多功能系統，尤其是中樞神經系統的衰老更明顯，會出現日益嚴重的記憶認知功能障礙[9]。在腦組織的衰老過程中，總是伴隨著一定量的神經元凋亡，導致神經元數量逐漸減少，從而引發腦部功能逐漸減退。機體的大腦海馬區是管理學習、記憶、認知功能的重要結構。大量的基礎研究和臨床研究表明，大腦海馬區是衰老、癡呆病變的主要部位之一，如海馬萎縮、神經元變性、丟失等[10-11]。實驗動物大腦海馬區受損傷可引起動物記憶、認知功能障礙，且嚴重程度與損傷度成正比[12]。臨床也發現，顱內腫瘤患者接受射線照射治療時，海馬輻射劑量越大，患者的記憶、認知障礙越嚴重[13]。本課題組前期研究也發現，老年癡呆大鼠的海馬病變明顯，結構萎縮模糊，神經元數量明顯減少[5-6]。因此，在防治衰老、癡呆的課題中，對海馬神經保護研究的意義重大。本課題發現，衰老小鼠的學習、記憶、認知功能明顯減退，這與其大腦海馬各區神經元數量減少有關。黃精地龍配伍可保護海馬神經，能明顯升高衰老小鼠海馬各區神經元數量，進而改善衰老小鼠的學習、記憶、認知功能，且呈現明顯的藥效關系。這與本課題組前期有關黃精地龍配伍抗大、小鼠老年癡呆的研究結果類似[3-6]。這些研究表明，黃精地龍配伍具有較好的防治老年癡呆、抗衰老的作用，其神經保護作用較明顯，且其有效性、重復性、穩定性均佳，具備臨床應用的實驗研究基礎。

機體一旦衰老，往往會出現一定程度的焦慮精神狀態，并伴隨著自發活動能力與探索行為能力的衰減[14-15]。曠場實驗箱是檢測動物焦慮程度、自發活動與探索行為能力的有效設施，小鼠在曠場中央區的活動時間反映其焦慮程度，中央區活動時間越長，焦慮程度則越低。小鼠的活動總路程長短可反映其自發活動能力與探索行為能力的強弱。本課題顯示，黃精地龍配伍可降低衰老小鼠的焦慮程度，提高其自發活動能力與探索行為能力。這表明，該配伍可緩解老年個體的精神焦慮狀態，調節其神經心理功能。

Bcl-2為關鍵的凋亡抑制基因，在維持細胞存活中發揮著重要作用，而Caspase-3則為重要的凋亡執行基因，細胞內此二者的表達活性狀態對細胞的抗凋亡與凋亡影響至關重要[16]。本課題還發現，衰老小鼠海馬各區Bcl-2表達明顯下降，Caspase-3表達明顯上升，這表明海馬神經元凋亡是導致衰老小鼠海馬神經元數量減少的重要因素。黃精地龍配伍能有效升高衰老小鼠海馬神經元Bcl-2表達、降低Caspase-3表達，發揮重要的抗海馬神經元凋亡作用。由此可知，黃精地龍配伍抗癡呆、抗衰老的作用與其通過抗神經細胞凋亡機制發揮神經保護的作用有關。

中醫對人體衰老或早衰的認識源遠流長，中醫理論認為衰老是由機體陰陽失調、精氣虧耗、臟腑虛衰、血瘀絡滯所致，其中，當以“腎虛致衰”為根本。腎元之陽氣和腎藏之精氣虧損、虛少，則五臟之氣血津液生化乏源，五臟氣血津液生化無源則導致諸多衰老病態和衰老過程[17-18]。因此，針對衰老病機，中醫采取補腎填精、益氣健脾、活血通絡、化痰開竅等治法抗衰老。黃精地龍配伍系本課題組依據中醫理論的自創方，組方精煉，方中黃精具有補氣養陰、健脾益腎等功效，常作食療[19]。地龍具有平肝祛風、通經活絡等功效，民間也可作食療之用[20]，兩者結合，既遵守中藥組方原則，又符合中醫藥食同源學說，可針對衰老、癡呆病機進行辨證論治。本課題組實驗已證實黃精地龍配伍抗衰老、抗癡呆的有效性和可重復性，在中醫臨床運用中也發現該配伍有效，但具體療效尚需進一步驗證。