基于網絡藥理學與分子對接探究荊芥-防風藥對防治新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的作用機制

蔣 暢，闞永軍，趙 立，肖 慶，韓 靜*，胡 娟

(1.福建省中醫(yī)藥科學院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003)

由新型冠狀病毒(2019-nCoV)引起的肺炎疫情(COVID-19)自2019年末暴發(fā)，肆虐至今，截至目前全球已有上百萬人被感染[1]。新冠肺炎是繼SARS、MERS后，由冠狀病毒引發(fā)的又一新型大范圍流行病，對公共安全造成了極大威脅。新冠肺炎患者前期出現(xiàn)乏力、干咳、胃腸道不適等癥狀，后期病情加劇，可出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征并引發(fā)膿毒性休克，嚴重危及患者生命[2-4]。尋找到針對新型冠狀病毒的特效藥物，抑制新冠肺炎的全球蔓延趨勢，是當前科研工作的重中之重。

在應對病原體尚未明確的新型突發(fā)性傳染病時，傳統(tǒng)中醫(yī)可在辨證論治的理論體系指導下進行有效診療，具有獨特優(yōu)勢[5]。中醫(yī)學將此類病毒導致的傳染性疾病歸于“溫病”范疇，在數(shù)千年的歷史實踐中積累了大量治療此類疾病的相關經驗，《金匱要略》《黃帝內經》等中醫(yī)經典中亦收錄了大量相關處方[6-8]。在當前緊迫的抗疫局勢下，從療效確切的中醫(yī)藥相關處方中尋找有效防治新冠肺炎的藥物刻不容緩。

國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中明確指出，新冠肺炎病在寒濕[9]。根據(jù)“風能勝濕”理論，常用藥對荊芥-防風廣泛應用于中醫(yī)溫病經方[10]，《本草求真》云：“用防風必兼荊芥者，以其能入肌膚宣散故耳。”《施今墨對藥臨床經驗集》云：“若屬外感證，用麻桂嫌熱、嫌猛；用銀翹嫌寒時，荊防用之最宜。”荊芥味辛，性溫，入肺、肝經；防風味辛、甘，性微溫，入膀胱、肝、脾經[11]，二者合用十分切合新冠肺炎的中醫(yī)病機，可能對防治新冠肺炎具有積極作用。

網絡藥理學分析注重系統(tǒng)性、綜合性、整體協(xié)調性，與中草藥多成分靶標、多途徑協(xié)同作用的特點具有相似性[12]。本研究采用網絡藥理學方法篩選荊芥-防風藥對防治新冠肺炎可能的作用靶標，并通過分子對接進行藥物-靶標結合位點分析，探討其防治新型冠狀病毒肺炎的可能作用機制，為尋找新冠肺炎防治藥物提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 活性成分與相關靶標的收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP(http：//tcmspw.com/index.php)對荊芥(SchizonepetaeHerba)、防風(SaposhnikoviaeRadix)的化學成分進行檢索，根據(jù)藥物動力學參數(shù)ADME，以生物利用率OB≥30%及類藥性DL≥0.18為標準進行進一步篩選，獲得荊芥-防風藥對的活性成分及其對應的靶標信息。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)獲取各靶標蛋白所對應的人類基因名，對靶標蛋白進一步標準化，建立數(shù)據(jù)集。

1.2 新冠肺炎靶標的收集

利用GenCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)，以“COVID-19”為關鍵詞，限定物種為“Homo Sapiens”，檢索并收集與新冠肺炎相關的基因靶標。

1.3 荊芥-防風藥對防治新冠肺炎的作用靶標預測

通過Venny(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將藥物預測靶標與新冠肺炎靶標進行映射，獲得荊芥-防風藥對防治新冠肺炎的潛在作用靶標并進行可視化分析。

1.4 基因富集分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)對“1.3”項中所收集的共同靶標進行GO(Gene Ontology)富集分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路富集分析，通過OmicShare(https：//www.omicshare.com/tools/)對結果進行可視化處理。

1.5 成分-靶標-通路網絡的構建

通過Cytoscape軟件，將“1.1”項中所收集的藥物活性成分、“1.3”項中所收集的共同靶標及“1.4”項中所得到的作用通路構建為“成分-靶標-通路”網絡并進行可視化，通過網絡分析獲得核心靶標及關鍵核心成分。

1.6 成分-靶標分子對接

通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找荊芥-防風藥對關鍵活性成分與部分現(xiàn)階段臨床報道有效藥物的2D結構，通過Chem 3D軟件優(yōu)化力學結構后保存，作為配體；通過PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/)查找SARS-CoV-2 3CL水解酶(PDB id：6M2Q)及ACE2(PDB id：1R42)的蛋白質3D結構，通過PyMol軟件刪除水分子及蛋白結構中的小分子配體后，加氫保存，作為受體；利用CB-Dock(http：//cao.labshare.cn/cb-dock/)進行分子對接。

2 結果

2.1 活性化合物與相關靶標篩選結果

中藥多為口服給藥，其體內過程包括吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代謝(Metabolism)、排泄(Excretion)，藥物的ADME屬性對預測藥物的生物活性及利用率有著重要意義。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，以口服生物利用率OB≥30%，類藥性DL≥0.18為篩選條件，篩查得到荊芥與防風的活性化合物分別為11個、18個，其中活性成分MOL000358、MOL000359為二者共有，刪除重復項后共獲得荊芥-防風藥對活性化合物27個，涉及212個靶標(見表1、表2)。

續(xù)表1

表2 荊芥-防風藥對活性化合物作用靶標

2.2 荊芥-防風藥對防治新冠肺炎的潛在作用靶標

將212個荊芥-防風藥對作用靶標與從GenCards數(shù)據(jù)庫中收集的350個新冠肺炎作用靶標進行映射，取交集共得到47個交叉靶標，即荊芥-防風藥對防治新冠肺炎的潛在作用靶標，見圖1。

圖1 荊芥-防風藥對與新冠肺炎靶標Venn圖

2.3 GO富集分析結果

將47個荊芥-防風藥對防治新冠肺炎的潛在作用靶標導入STRING數(shù)據(jù)庫，從生物學過程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular function，MF)和細胞組分(Cellular component，CC)三個部分進行富集分析，可知荊芥-防風藥對參與了細胞因子介導的信號通路、炎癥反應、細胞凋亡以及蛋白受體結合等相關生物學過程，結果見表3、表4、表5。

表3 GO富集分析(BP)Top30

表4 GO富集分析(CC)Top20

表5 GO富集分析(MF)Top30

2.4 KEGG富集分析結果

通過STRING數(shù)據(jù)庫對47個荊芥-防風藥對防治新冠肺炎的潛在作用靶標進行KEGG信號通路富集分析，以FDR值與基因相關數(shù)進行排序，取前20條為顯著相關通路，涉及IL、NF-κB信號通路以及甲型流感、皰疹病毒感染、結核等多條感染相關通路，結果見圖2。

圖2 KEGG富集結果(Top20)

2.5 成分-靶標-通路網絡

利用Cytoscape軟件處理“1.1”項中所收集的藥物活性成分、“1.3”項中所收集的共同靶標及“1.4”項中所得到的作用通路，構建為“成分-靶標-通路”網絡并進行可視化處理，結果見圖3。該網絡共有90個節(jié)點，430條邊。藍色矩形各點代表荊芥-防風藥對中的有效化合物，黃色圓圈與紅色圓圈中各個點分別代表不同的作用靶標和通路。網絡拓撲學分析結果表示，該網絡節(jié)點的平均度值為9.56，大于平均度值的節(jié)點共43個，平均中介中心度為18.02，大于平均中介中心度的節(jié)點有33個，以網絡拓撲學核心特征節(jié)點度值、中介中心度均大于平均值為條件進行篩選顯示，槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、β-谷固醇等有效化合物及IL-6、TP53、CASP3、IL10、MAPK1、CXCL8、CCL2、IL1B、MAPK14、RELA、PTGS2、IL4、FOS等作用靶標在荊芥-防風藥對的化合物-作用靶標-通路網絡中具有重要作用，涉及多條病毒性感染、免疫調控、炎癥通路，這可能是荊芥-防風藥對發(fā)揮新冠肺炎防治效果的核心化合物、作用靶標以及通路。

圖3 成分-靶標-通路網絡

2.6 分子對接結果分析

將荊芥-防風藥對中排序前4位的核心活性化合物及部分現(xiàn)階段臨床報道有效的藥物(氯喹、瑞德西韋、利托那韋、洛匹那韋)通過CB-Dock與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2進行分子對接，預測藥物與蛋白靶標之間的相互作用模式。結果顯示，荊芥-防風藥對中的核心活性化合物與ACE2及2019-nCoV水解酶對接Vina得分均小于-6，且最優(yōu)結合位點大多與現(xiàn)階段臨床報道有效藥物結合位點一致，提示核心活性化合物與蛋白靶標之間發(fā)生相互作用的可能性較大(見表6)，核心活性化合物與蛋白靶標結合示意圖見圖4、圖5。

表6 藥物-靶標分子對接匯總

圖4 荊芥-防風藥對核心化合物與ACE2分子對接

圖5 荊芥-防風藥對核心化合物與2019-nCoV3CL水解酶分子對接

3 討論

新冠肺炎屬于中醫(yī)學“溫病”范疇，以寒濕邪毒為主要病因病機，患者前期主訴食少便溏而非發(fā)熱。荊芥-防風為臨床常用辛溫解表藥對，荊芥祛風解表、宣毒透疹、理血止痙；防風祛風解表、疏肝解痙、殺蟲止癢。現(xiàn)代藥理學研究證實二者均可解熱鎮(zhèn)痛、抗菌消炎、增強免疫功能，具有相似的藥理作用[13-15]。可見，新冠肺炎的發(fā)病特點、臨床癥狀、中醫(yī)證候與荊芥-防風藥對的臨床應用相符，該藥對具有防治新冠肺炎的可能性。

在本研究中，藥物成分-基因靶標-疾病網絡共有90個節(jié)點、430個連接，在一定程度上反映了藥物與靶標之間相互作用的復雜性。通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，荊芥-防風藥對防治新冠肺炎的可能生物過程涉及細胞反應、信號傳導、免疫調節(jié)、細胞凋亡等；細胞組成涉及膜筏、轉錄因子復合體、受體因子復合體等；分子功能涉及蛋白受體結合、激酶活化、轉錄因子結合等。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，荊芥-防風藥對涉及皰疹病毒感染、利什曼病、查加斯病、乙型肝炎、結核、百日咳、甲型流感等多條病毒感染通路，其防治新冠肺炎的可能機制與TNF信號通路、NF-κB信號通路介導細胞炎性因子IL-17有較為緊密的聯(lián)系。

2019-nCoV與SARS-CoV的感染途徑相同，均通過病毒表面S蛋白與宿主細胞ACE2結合入侵[16]。藥物作用于ACE2特異性位點可阻斷病毒S蛋白與之結合，達到防治目的。2019-nCoV 3CL水解酶負責水解多聚蛋白，使之具有復制及轉錄功能，是新冠病毒復制過程中的重要一環(huán)[17]。分子對接結果顯示荊芥-防風藥對核心活性化合物對ACE2和2019-nCoV 3CL水解酶均具有較好的結合性，且最優(yōu)結合位點大多與現(xiàn)階段臨床報道的有效藥物的結合位點一致。該結果進一步證明了荊芥-防風藥對作用于新冠肺炎關鍵靶標蛋白的可能性以及網絡藥理學分析預測的可靠性。

綜上所述，荊芥-防風藥對可能通過多種活性化合物調控細胞因子，參與炎性反應及免疫應答過程，介導多條炎癥、感染相關信號通路，發(fā)揮防治新冠肺炎的作用。這一獨特的作用機制體現(xiàn)出了中藥治療疾病多成分靶標、多途徑協(xié)同作用的特點。本研究通過網絡藥理學方法結合分子對接技術對荊芥-防風藥對防治新型冠狀病毒肺炎的潛在物質基礎與作用機制進行了初步探究，為后續(xù)相關制劑開發(fā)研究奠定了基礎。

目前大多數(shù)分子對接工具都需要在用戶預先設定對接位置坐標的基礎上進行擬合[18]，本次研究所采用的CB-Dock可通過perl腳本自動計算空腔中心并應用于AutoDock Vina計算[19]，結果更為精準可信。但需要注意的是，受限于目前計算機擬合方法本身的局限性，分子對接計算結果可能與實際臨床療效不盡相同，只有立足于臨床藥效觀察情況，開展相關實驗研究對計算結果進行驗證，方能去偽存真，為中藥防治新冠肺炎提供更加充分有力的證據(jù)。