RNA m6A甲基化參與腎臟纖維化進展的實驗研究

陳靜 張函 顧玉露 丁小強 章曉燕

200032 上海，復旦大學附屬中山醫院腎內科

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是一種嚴重危害人類健康的慢性疾病。RNA甲基化主要發生在N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)位點[1]。m6A修飾在基因表達調控、mRNA剪接、RNA穩定性等方面扮演重要角色[2]。m6A修飾主要由甲基化酶(writers)、去甲基化酶(erasers)和識別蛋白(readers)所調控，參與RNA剪接、出入核、蛋白質翻譯及降解等多種生物學過程[3-5]。甲基化RNA免疫共沉淀結合高通量測序(Methylated RNA Immunoprecipitation with next generation sequencing，MeRIP-seq)[5]，使用N6-甲基腺嘌呤抗體富集高甲基化的RNA片段，并通過結合高通量測序，能夠高效精確的在全轉錄組范圍內檢測發生甲基化的RNA區域。通過使用這一技術，我們可以比較不同細胞、組織、樣本間的RNA甲基化修飾模式的差異，發現疾病發生、發展過程中的關鍵生物學改變[6-7]。

近年研究表明，m6A在腫瘤發生、發展中發揮重要作用[1]。但在腎臟纖維化發生過程中m6A變化如何、扮演什么角色？目前還不明確。本研究基于MeRIP-seq數據庫解析腎臟纖維化發生過程中RNA m6A的變化，篩選出差異基因和關鍵通路，初步確定參與調控RNA m6A的關鍵甲基酶，為腎臟纖維化的RNA甲基化機制研究提供重要理論參考。

材料與方法

一、實驗動物與試劑

1.動物 健康的6～8周齡雄性小鼠(種系C57BL/6)，重量19～24 g，購自上海杰思捷生物科技有限公司，自由進食飲水。

2.試劑 PrimeScript RT試劑盒(日本Takara公司)、RNAiso Plus(Trizol)(美國Thermo公司)、SYBR Green PCR試劑盒(日本Takara公司)

二、方法

1.動物模型與實驗分組 C57BL/6小鼠適應環境7 d。采用隨機數字表法分成2組：假手術組(Sham組)(n=6)、腎臟纖維化組(UUO組)(n=6)。UUO組經小鼠背部右側切口將小鼠右側輸尿管游離、結扎并剪斷，Sham組僅游離右側輸尿管不結扎。造模7 d后收集腎組織標本。

2.mRNA樣品制備 利用Trizol法提取總RNA并檢測RNA的濃度和純度。使用rRNA試劑盒去除rRNA，瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA完整性。然后高頻超聲儀隨機打斷RNA樣本，將片段化的RNA與m6A抗體加入IPP緩沖液中，4 ℃孵育2 h。進一步反應混合物用protein A磁珠在4 ℃環境下免疫沉淀2 h。之后用游離的m6A腺苷類似物洗脫磁珠上結合的mRNA。洗脫的mRNA進一步通過Trizol試劑(Thermo Fisher)進行抽提。抽提純化的RNA進行質譜檢測，并進一步MeRIP-seq測序(上海云序生物公司)。

3.RT-PCR檢測 根據已有文獻報道，選取目前已知m6A關鍵調控酶甲基轉移酶樣蛋白(methyltransferase-like protein,METTL)3、METTL4、METTL14、肥胖相關基因(fat mess and obesity us sociated,FTO)、ALKBH5基因進行RT-PCR檢測。所用引物均由上海生工生物技術有限責任公司合成，具體引物序列見表1，其中18s作為內參對照，采用2-ΔΔct分析方法計算目的基因的表達差異。

表1 RT-PCR引物列表

4.免疫組化檢測 使用Abcam公司的METTL14抗體(貨號：ab252562，抗體使用濃度1∶200)，檢測小鼠腎臟組織METTL14的表達情況。

三、統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件，所有RT-PCR結果數據以Mean±SD表示，進行單因素方差分析。采用Dunnet’s T3法分析組間差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、質譜結果

首先通過MASSON染色，證實腎臟纖維化模型造模成功(P<0.05)。我們使用質譜法檢測兩組RNA m6A含量變化(由復旦大學生物醫學研究院提供技術支持)，發現UUO組腎臟RNA m6A含量顯著升高(P<0.05)。(圖1)

二、測序結果

我們使用Ilumina平臺對Sham組和UUO組腎組織樣本RNA m6A進行比較發現，與對照組相比，UUO處理腎臟差異表達1.5倍以上的差異甲基化的編碼基因共1 352個，其中上調906個，下調446個，包括細胞連接、炎癥反應、轉分化、鈣離子結合、細胞黏附等相關的基因。(圖2～3)

三、m6A關鍵調控酶的篩選

采用RT-PCR檢測METTL3、METTL4、METTL14、肥胖相關基因(fat mass and obesity associated，FTO)、ALKBH5基因的表達差異情況。進一步通過免疫組化方法，我們發現METTL14在腎臟的主要表達部位為腎小管上皮細胞的細胞核，UUO組腎臟METTL14表達顯著升高(P<0.05)。由此，我們推測RNA m6A甲基轉移酶METTL14可能是腎臟纖維化過程中m6A的關鍵調控酶。(圖4)

討 論

本研究通過高通量測序的方法，研究了RNA m6A修飾在UUO小鼠纖維化腎臟的變化發現，纖維化腎臟m6A含量顯著升高。我們還初步篩選了引起m6A變化的調控酶，發現METTL14在UUO組顯著升高，可能是引起m6A參與腎臟纖維化的關鍵調控酶。

m6A甲基化修飾是一種動態可逆的反應，由甲基化酶、去甲基化酶和甲基化閱讀蛋白共同參與[8-10]。RNA m6A修飾主要由甲基轉移酶系催化進行，以METTL3和METTL14最為重要。甲基轉移酶的主要作用就是催化mRNA上腺苷酸發生m6A修飾。而去甲基化酶包括FTO和ALKBH5等，它的作用是對已發生m6A修飾的堿基進行去甲基化修飾，使RNA甲基化成為一種可逆的反應[8-9]。研究還發現m6A甲基轉移酶(如METT14)和去甲基酶(如FTO)分別作為編碼器和消碼器。m6A的閱讀器可以選擇性地結合到含有m6A修飾位點的RNA上，從而介導下游基因表達調控效應。國內外越來越多的學者在胚胎干細胞的維持和分化、晝夜節律改變、熱休克反應、減數分裂進展和神經元功能等方面開展了m6A的深入研究[10]。然而，目前仍有大部分RNA修飾的生物學作用未被發現，尤其是m6A甲基化在腎臟纖維化發生和發展中的作用。

本研究通過高通量測序的方法，分析了RNA m6A修飾在UUO小鼠纖維化腎臟RNA m6A甲基化差異位點的變化。這些差異化位點基因包括細胞連接、炎癥反應、轉分化、鈣離子結合、細胞黏附、血管鈣化等，其中差異最顯著的基因Cyclin D1在調控細胞周期中發揮重要作用，為本課題后續的分子機制研究提供了重要依據。在本研究中，我們還通過RT-PCR實驗初步篩選了參與調控RNA甲基化的關鍵調控酶，發現METTL14可能是引起腎臟纖維化過程中一系列基因表達改變的關鍵酶。由此我們推斷METTL14可能是RNA甲基化參與腎臟纖維化的關鍵調控酶。結合目前RNA甲基化的系列研究，我們將圍繞甲基化酶METTL14在腎臟纖維化中的作用開展深入研究。本研究的不足之處，我們只觀察了輸尿管梗阻后7 d的腎組織RNA m6A表達變化，對于梗阻后RNA m6A的動態變化過程沒有進行觀察，所以不能對其與腎臟纖維化發生、發展的相關性做出有效的預測。

RNA表觀遺傳學已成為表觀遺傳學中一個快速發展的研究熱點，在未來人類疾病的治療方面有很好的發展前景[11-15]。因此，深入研究和探討RNA甲基化在腎臟纖維化的生物學作用，將加深我們對腎臟纖維化病理機制的理解，為臨床診斷和治療提供新思路。