超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜法測定塑料食品接觸材料中9種熒光增白劑

張麗妮，鄒 孝，余文琴，但家宇，唐加利，高亞凱

（1.重慶市計量質量檢測研究院，重慶 401121；2.重慶大學化學化工學院，重慶 401331）

近年來，食品接觸材料遷移帶入的食品安全問題已經引起了食品安全監管部門的注意。這些食品接觸材料常使用的一些化學染料，如熒光增白劑，它在塑料材料中大量使用，是一種容易殘留并遷移到食品中的有毒有害物質。據醫學實驗報道，熒光增白劑可使細胞產生變異，會通過與接觸的食品遷移進入人體或直接與人體表面皮膚接觸[1]。雖然食品接觸材料中批準使用的適量熒光增白劑屬低毒風險，但違規添加及過量使用則會對人體健康構成威脅，同時也是潛在的致癌因素之一[2-3]。我國GB 9685—2016《食品接觸材料及制品用添加劑使用標準》標準，歐盟2002/72/EC號指令及美國聯邦法規21CFR178.3297均制定了允許用于生產食品接觸材料和制品的熒光增白劑清單，同時還規定了最大使用量和特定遷移限量，如熒光增白劑FWA184，我國標準和歐盟標準一致，均規定其特定遷移限量為0.6 mg/kg，美國聯邦法規則規定其加入量不得超過0.015%[4-7]。

目前，關于洗滌用品、紡織用品、塑料制品中熒光增白劑的檢測技術多有報道[8-9]，國內外學者針對熒光增白劑的研究主要有紫外分光光度法[10]、熒光光度法[11-12]、高效液相色譜法和超高效液相色譜法[13-20]、液相色譜-串聯質譜法[21-29]等。紫外分光光度法和熒光分光光度法設備簡單、操作易行、檢測速率較快，但是干擾因素多、靈敏度不高，只能測定單一熒光增白劑或熒光增白劑總量，無法分析具體種類，而且環境因素對結果有影響；高效液相色譜法是目前技術相對成熟的一種檢測手段，對于較為復雜的基質易受雜質干擾，檢測結果準確性難以保證，且在分析多化合物時，不易分離或者分析時間過長；液相色譜-串聯質譜法則是結合了液相色譜和質譜的優點，通過保留時間與特征離子對目標物進行定性與定量分析，具有其他分析方法無可比擬的優勢，對于復雜化合物的定性定量更為準確，因此，近些年學者開始研究開發液相色譜-串聯質譜法同時測定食品接觸材料多種熒光增白劑的檢測方法。如呂水源等[30]建立了高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜同時測定塑料食品接觸材料中OB、OB-1、EBF、KCB 4 種熒光增白劑含量的檢測方法；許健等[31]建立了采用液相色譜-串聯質譜法測定發泡聚苯乙烯餐具中FWA135、FWA184、FWA185、FWA199、FWA367、FWA368、FWA378、FWA393 8 種熒光增白劑的含量。

雖然超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜法測定塑料食品接觸材料中熒光增白劑已有報道，但目前仍沒有超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜法測定塑料食品接觸材料中熒光增白劑的檢測標準，前人在研究時存在一些不足，一是研究選擇的材質比較單一，二是對于多種熒光增白劑同時檢測的論述較少。本實驗在前人研究的基礎上，以市場上常見的食品接觸材料為對象，在提取溶劑選擇和色譜條件優化方面進行了大量的工作，以期建立一種適合多種塑料食品接觸材料材質中9 種熒光增白劑同時檢測的超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜法，為市場監管部門調查食品接觸材料中的熒光增白劑含量提供技術支持，同時也為相關標準的制定提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

塑料食品接觸材料樣本購自本地超市、甜品店、飯店；FWA199、FWA135、FWA378標準品（純度＞98%） 上海安譜實驗科技股份有限公司；FWA184、FWA52、FWA393 標準品（純度＞98%） 北京百靈威科技有限公司；FWA367標準品（純度＞98%） 英國Fluorochem化學有限公司；FWA185、FWA368對照品（純度＞95%） 濟南塑邦精細化工有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純） 成都科隆化學品有限公司；乙酸銨（色譜純） 美國Fisher Chemical公司；三氯甲烷（分析純） 重慶川東化工（集團）有限公司。

1.2 儀器與設備

UPLC 1290/API 4000型超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀（配有電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI）） 美國Agilent公司/美國Sciex公司；Quintix224-1CN電子天平 德國Sartorius公司；PP020XXM1&PF2XXXXM1超純水機 英國Elga公司；VORTEX3旋渦混合器 德國IKA公司；3K15離心機德國Sigma公司；KH5200DE超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；MD200-2氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACOUITY UPLC?HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相；A為0.1%甲酸-乙腈溶液，B為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.3.2 質譜條件

ESI正離子模式；多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度600 ℃；碰撞氣（N2）壓力6 psi；氣簾氣（N2）壓力30 psi；霧化氣（N2）壓力60 psi；輔助加熱氣（N2）壓力60 psi；碰撞室出口電壓14 eV。監測離子對、定量離子、去簇電壓、碰撞能量見表2。

表2 9 種熒光增白劑的質譜參數Table 2 Mass spectrometric parameters for nine fluorescent whiteners

1.3.3 標準曲線的繪制

精密稱取各標準品25 mg，分別置于25 mL棕色容量瓶中，用三氯甲烷溶解并定容至刻度，混勻，配制成質量濃度為1 000 mg/L的單標儲備溶液，-18 ℃保存；將FWA52、FWA135、FWA184、FWA185、FWA367配成混合標準中間溶液，用甲醇逐級稀釋為線性范圍0.5～100 ng/mL，將FWA199、FWA368、FWA378、FWA393配成混和標準中間液，用甲醇逐級稀釋為線性范圍5～1 000 ng/mL。以待測物質量濃度為橫坐標，以定量離子質量色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 樣品處理

選取食品接觸類塑料包裝，如：飲用水瓶（聚對苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET））、密胺餐具（密胺樹脂（melamine resin，MF））、一次性餐盒（聚丙烯（polypropylene，PP））、方便面桶（聚乙烯（polyethylene，PE）內膜）、復合膜包裝袋（雙向拉伸尼龍/低密度聚乙烯（biaxially oriented polyamide(nylon) film/low-density polyethylene，BOPA/LDPE）復合）、鍍層塑料包裝（CPP鍍鋁膜）6 種材質17 個代表性樣品，剪成小于5 mm×5 mm的碎片，混勻后分別裝入潔凈容器作為試樣，密封并做標識。

樣品前處理：稱取0.5 g（精確至0.1 mg）已混勻的樣品于25 mL具塞棕色玻璃比色管中，加入10 mL三氯甲烷，渦旋0.5 min，于40 ℃超聲提取30 min，以6 000 r/min離心5 min，轉移上清液至氮吹管中，繼續加入10 mL甲醇至比色管中，渦旋0.5 min，于40 ℃超聲提取30 min，以6 000 r/min離心5 min，轉移并合并2 次提取的上清液，于40 ℃氮吹至近干，殘渣用1.0 mL甲醇復溶，過0.22 μm微孔有機濾膜后供超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜測定。

加標樣品制備：稱取0.5 g（精確至0.1 mg）經前期檢測為陰性的試樣于25 mL具塞棕色玻璃比色管中，加入適量混合標準溶液，室溫放置，待樣品吸收標液至干后，按上述步驟進行前處理。

1.3.5 提取溶劑選擇

本實驗以提取回收率為指標，以6 種材質為基質，對甲醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）溶劑進行比較研究，并確定合適的提取溶劑。

1.3.6 檢出限與定量限

按照1.3.4節樣品提取條件，以經前期測試不含本研究9 種熒光增白劑的樣品為本底，用陰性樣品加標實驗，以3 倍信噪比計算檢出限，以10 倍信噪比計算定量限。1.3.7 回收率與精密度

按照1.3.4節樣品提取條件，以經前期測試不含本研究9 種熒光增白劑的樣品為本底，取樣品0.5 g，分別添加定量限的1、2 倍和10 倍3 個水平進行回收率實驗和精密度實驗，每個添加量進行6 次平行實驗，同時做空白實驗，均扣除本底值后計算加標回收率和相對標準偏差。

1.4 數據處理

實驗結果統計分析采用WPS 2019表格，圖像處理方法采用Origin 2018。

2 結果與分析

2.1 液相色譜條件的優化

據文獻報道，液相色譜-質譜法檢測熒光增白劑主要使用的流動相通常為0.1%甲酸-乙腈（A）和水（B）[21]；0.1%甲酸-甲醇（A）和0.1%甲酸（B）[30]；乙腈（A）和乙酸銨緩沖溶液（B）[31]。實驗在借鑒前人使用流動相的基礎上對色譜條件進行優化，發現對本實驗的9 種目標熒光增白劑的分離效果不佳，峰形差。為了達到良好的分離效果和峰形，從流動相pH值穩定性和離子強度進行改進。對比研究0.1%甲酸-乙腈（A）和0.1%甲酸溶液（B）、0.1%甲酸-甲醇（A）和0.1%甲酸溶液（B）、0.1%甲酸-乙腈（A）和0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液（B）、0.1%甲酸-甲醇（A）和0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液（B）4 種流動相組合。首先使用0.1%甲酸-乙腈（A）-0.1%甲酸（B）和0.1%甲酸-甲醇（A）-0.1%甲酸（B）作為流動相時，分離度因個別峰的峰形寬及拖尾嚴重造成總離子流圖分離效果不佳，而后考慮加入5 mmol/L乙酸銨緩沖鹽使流動相保持一定的離子強度以改善峰形，使用0.1%甲酸-甲醇（A）-0.1%甲酸-乙酸銨（B）流動相時效果明顯，分離效果好、峰形好、響應高，但檢測時間稍長，考慮到這9 種熒光增白劑的極性偏弱，選擇0.1%甲酸-乙腈（A）-0.1%甲酸-乙酸銨（B）流動相時，洗脫能力增強，9 種熒光增白劑的保留時間減少，經過梯度程序優化，同樣能達到很好的分離效果，響應更高，尤其是FWA378、FWA367、FWA184，比0.1%甲酸-甲醇（A）-0.1%甲酸-乙酸銨（B）流動相體系高3～5 倍。最終選擇0.1%甲酸-乙腈（A）-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨（B）溶液作為流動相，并優化梯度洗脫程序。9 種熒光增白劑色譜分離的總離子流圖見圖1。

圖1 9 種熒光增白劑色譜分離的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms for chromatographic separation of nine fluorescent whiteners

2.2 提取溶劑的選擇

考慮到本實驗的9 種目標熒光增白劑屬于脂溶性熒光增白劑，提取溶劑需選擇有機溶劑。在前人的研究中，劉杰等[13]研究了三氯甲烷和甲醇對脂溶性熒光增白劑的提取效果，結果表明三氯甲烷-甲醇（4∶1，V/V）能夠兼顧回收率和峰形，吳鐘玲等[32]研究了甲醇、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、DMF對脂溶性熒光增白劑的提取效果，結果表明三氯甲烷是最佳提取劑。葉玲等[33]比較研究三氯甲烷、甲醇、乙腈對熒光增白劑的提取效果，結果顯示三氯甲烷為最佳提取劑。本實驗選取甲醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、DMF為提取劑，在相同條件下（室溫超聲提取30 min，料液比0.5 g/10 mL），對6 種不同材質的自制陽性樣品進行測試，比較不同材質食品接觸材料中熒光增白劑在不同提取溶劑中的提取效果，由圖2可以看出，和前人研究結果一致，三氯甲烷和甲醇對6 種材質的食品接觸材料中熒光增白劑的提取效果均優于其他試劑，但二者對不同的熒光增白劑有著不同提取效率，前人的研究以使用三氯甲烷為主，甲醇的作用多為沉淀高聚物以減少雜質的干擾[31]，并沒有考慮甲醇對個別熒光增白劑的萃取作用。本實驗在探索過程中發現甲醇對FWA52、FWA185、FWA368、FWA378的提取效果優于三氯甲烷，劉杰等[13]研究發現，三氯甲烷和甲醇作為提取溶劑時，甲醇含量超過三氯甲烷的1/4會導致目標熒光增白劑和高聚物一起析出，影響回收率，因此本實驗嘗試采用前人未曾摸索的兩種溶劑分兩步提取法，先用三氯甲烷超聲提取30 min，再用甲醇超聲提取30 min，合并2 次提取溶液，氮吹至近干后用1 mL甲醇溶解殘渣，過0.22 μm有機濾膜，上機檢測，圖3表明，分2 次提取6 種材質食品接觸材料中的9 種熒光增白劑，雖然FWA52回收率較甲醇單獨提取有所降低，但9 種熒光增白劑整體回收率明顯優于甲醇和三氯甲烷單獨提取的效果，說明三氯甲烷和甲醇分別提取熒光增白劑能夠起到互補作用。

圖2 提取溶劑對6 種食品接觸材料中9 種熒光增白劑回收率的影響Fig. 2 Effect of extraction solvents on the recovery of nine fluorescent brighteners in six food contact materials

圖3 甲醇、三氯甲烷、三氯甲烷和甲醇分2 次提取對6 種食品接觸材料中9 種熒光增白劑回收率的影響Fig. 3 Effects of individual and sequential extraction with chloroform and methanol on on the recovery of 9 fluorescent whitening agents in six food contact materials

2.3 質譜條件的優化

質譜條件的優化通過在流動注射模式下對1.0 μg/mL的9 種熒光增白劑單獨進樣完成。根據9 種熒光增白劑的化合物結構，選擇在正離子模式下進行優化。采用一級質譜對目標化合物進行母離子全掃描，分析得到[M+H]+分子離子峰；再采用二級質譜，以分子離子為母離子，優化去簇電壓、碰撞能量參數，對目標化合物的子離子進行全掃描，每種熒光增白劑選擇2 個信號穩定且強度高的m/z為定性離子對，選著其中信號強度高且受基質干擾小的m/z為定量離子對，結果見表2。9 種熒光增白劑提取離子色譜見圖4。

圖4 9 種熒光增白劑提取離子MRM色譜圖Fig. 4 Extracted ion MRM chromatograms of nine fluorescent whiteners

2.4 線性范圍、檢出限和定量限測定結果

根據1.3.3節方法配制混合標準系列，經測試分析后得出標準曲線，用陰性樣品加標實驗，計算檢出限和定量限，結果見表3。9 種熒光增白劑在0.5～1 000 ng/mL范圍線性良好，相關系數均大于0.9 9 9，檢出限為0.05～3.2 μg/kg，定量限為0.2～10 μg/kg，本方法線性范圍寬、靈敏度高。

表3 9 種熒光增白劑的線性回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限和定量限Table 3 Linear regression equations, correlation coefficients,linear ranges, detection limits and quantitative limits for nine fluorescent brighteners

2.5 加標回收率和精密度實驗結果

如表4 可知，9 種熒光增白劑的平均回收率在76.11%～106.55%之間，相對標準偏差在1.97%～8.31%之間，表明本方法回收率穩定，可滿足實際樣品的檢測要求。

表4 9 種熒光增白劑的加標回收率和精密度（n=6）Table 4 Recoveries and precision of nine fluorescent brighteners from spiked samples (n= 6)

2.6 實際樣品分析結果

采用最優條件下的實驗方法對從超市、甜品店、飯店購買的17 個樣品進行測試，結果見表5，圖5為典型陽性樣品（YP-16）中檢出熒光增白劑（FWA393）的總離子流圖和質譜圖。由表5可看出，有15 個樣品檢出不同程度的熒光增白劑，主要集中在FWA135、FWA184、FWA378、FWA393，FWA393最高檢出含量1 380 μg/kg，而FWA135、FWA184、FWA378并不允許在食品接觸用塑料材料及制品中使用，由此可見，檢出樣品可能是由于污染帶入，或者是人為在塑料制品中違規使用禁用熒光增白劑，需要市場監管部門加強監督管理。同時本課題在接下來的研究中會對特定遷移量的模擬實驗進行研究。

表5 塑料食品接觸材料實際樣品中9 種熒光增白劑的含量Table 5 Contents of nine FWAs in actual samples of plastic food contact materials determined by the proposed method

圖5典型陽性樣品（YP-16）中檢出熒光增白劑（FWA393）的總離子流圖（A）和質譜圖（B）Fig. 5 Total ion current chromatogram (A) and mass spectrum (B) of fluorescent brightener (FWA393) in typical positive samples (YP-16)

3 結 論

本實驗建立了同時測定塑料食品接觸材料中FWA52、FWA135、FWA184、FWA185、FWA199、FWA367、FWA368、FWA378、FWA393 9 種熒光增白劑含量的超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜檢測方法。該方法條件下9 種熒光增白劑檢出限為0.05～3.2 μg/kg，定量限為0.2～10 μg/kg，在0.5～1 000 ng/mL范圍線性良好，相關系數均大于0.9 9 9，加標回收率范圍為76.11%～106.55%，相對標準偏差（n=6）為1.97%～8.31%，均符合方法確認的要求，本方法成功應用于塑料食品接觸材料中9 種熒光增白劑的快速定性定量分析，為檢測方法標準的制定提供依據，同時為食品安全監管提供技術支持。