融合圖譜特征信息的明蝦揮發性鹽基氮含量無損檢測

王 婭，張存存，付玉葉，張 凡，王 頡，王文秀

（河北農業大學食品科技學院，河北省農產品加工工程技術中心，河北 保定 071000）

明蝦肉質鮮嫩營養豐富，深受消費者喜愛。新鮮度是衡量明蝦品質及加工適宜性的重要指標，在捕撈、運輸和貯藏等環節時的新鮮度檢測至關重要[1]。傳統的水產品新鮮度判定方法主要有感官評價[2]、理化檢測[3]、微生物檢測[4]等。然而，上述檢測方式尚存在一些弊端，如檢測過程耗時過長和容易受主觀影響等[5]，因此無法滿足快速、無損檢測的需求。其中，揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量一直被認為是評判蝦肉新鮮度最重要的一個指標[6-7]，因而構建一種明蝦中TVB-N含量快速檢測的方法具有重要的意義。

近年來，光學檢測技術逐漸發展，例如光譜學、計算機視覺和高光譜成像技術等，并已在水產品上有所應用。王琦[8]、高亞文[9]、Lan Weiqing[10]等綜述了近紅外光譜技術在水產品檢測中的應用，表明該技術能夠在不破壞樣品的情況下，對水產品中水分含量、蛋白質含量、菌落總數、TVB-N含量和pH值等參數進行檢測。張安紅[11]利用近紅外光譜技術測定了對蝦中TVB-N含量，建立的偏最小二乘模型的預測相關系數達到了0.911，表明近紅外光譜技術可以快速無損檢測對蝦中TVB-N含量。Hosseinpour等[12]利用機器視覺技術實現了烘干過程中蝦色變化的實時監測。Dai Qiong等[13]利用可見-近紅外高光譜成像系統（400～1 000 nm）與小波分析相結合確定冷藏期間對蝦的TVB-N含量。程旎[14]將光譜特征與圖像特征進行融合建立無損快速檢測淡水魚TVB-N含量的方法，結果表明，融合模型的預測能力高于單一的近紅外光譜和機器視覺模型。綜合現有研究可知，高光譜技術能夠同時獲得圖像與光譜信息，但由于設備成本過高，數據量過大，限制其在實際中的應用[15]。為了實現新鮮度的快速準確測定，開發融合近紅外和機器視覺技術的檢測方法具有重要的應用價值，而目前融合圖譜信息對明蝦中TVB-N快速檢測的研究仍鮮有報道。

針對上述問題，本研究融合特征圖譜信息構建了明蝦TVB-N含量的快速檢測方法，并將其與單獨利用近紅外光譜信息和圖像信息進行對比分析。首先，基于近紅外光譜技術，對比不同波段范圍和不同預處理方法對建模結果的影響，構建明蝦近紅外光譜與TVB-N含量之間的支持向量機（support vector machine，SVM）模型。然后，利用搭建的機器視覺圖像采集系統，獲取不同新鮮程度明蝦樣品的圖像，提取圖像特征信息并與TVB-N含量建立SVM模型；最后，為了進一步提高TVB-N定量分析模型的精度，融合圖譜特征信息構建明蝦新鮮度檢測的SVM模型，并對不同模型的差異進行對比分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明蝦 市購。

鹽酸 天津市永大化學試劑開發中心；氧化鎂、三氯乙酸、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠 國藥集團化學試劑有限公司；95%乙醇 天津市通新化工公司；所用化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

K1100型全自動凱式定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司；FLAME-S-VIS-NIR-ES可見-短波近紅外光譜儀（波長范圍為350～1 000 nm，數據采集間隔為0.38 nm）、FLAME-NIR近紅外光譜儀（波長范圍為940～1 650 nm，數據采集間隔為5.36 nm） 美國海洋光學公司；CCD相機、MV-EM 200C（分辨率為1 600×1 200）、BT-118C0820MP5鏡頭 北京維視圖像公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

樣品均為當日凌晨從渤海海域養殖區運至的新鮮明蝦，質量為14～18 g，體長為10～15 cm。將活蝦置于0 ℃冰水混合物中15 min使其猝死，瀝干后用自封袋包裝并置于4 ℃冰箱中冷藏，每天取4 只進行實驗，連續測定13 d，共獲得有效樣品51 個。

1.3.2 光譜信息采集

利用自行搭建的可見-近紅外光譜采集系統獲取明蝦樣品的反射光譜。該系統主要包括可見-短波近紅外光譜儀（以下簡稱波段一）、近紅外光譜儀（以下簡稱波段二）、光源、Y形光纖、計算機等，系統結構示意圖如圖1所示。Y形光纖的分叉端分別通過SMA905接口與兩臺光譜儀連接，光纖探頭端置于載物臺正上方，與樣品表面的距離為6 mm。所用光源為2 個12 V、5 W的鹵素燈，呈45°對稱分布置于載物臺上方。雙波段光譜儀通過USB數據線與計算機連接。

圖1可見-近紅外光譜采集系統示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the visible-near-infrared spectrum acquisition system

實驗時，首先打開儀器預熱30 min，使其處于較為穩定的工作狀態。然后取出冷藏的明蝦樣品，用濾紙吸干表面水分。在采集樣品光譜前，先將光纖對準聚四氟乙烯標準白板，調整光譜儀積分時間使光強達到總量程的80%。本研究中波段一和波段二光譜儀的積分時間分別為27 ms和400 ms，平均次數分別為5和1，平滑度分別為5和3。依次獲取參比光譜和暗背景光譜后，將樣品置于載物臺時，采集其第2腹節、第3腹節和接近尾部3 個不同位置處的反射光譜，求取平均后作為該樣品的最終光譜。實驗環境溫度維持在（25±1）℃，濕度為（30±5）%。為了減小外部環境光的影響，實驗在密閉的暗箱中進行。

1.3.3 圖像信息采集

圖2 圖像采集系統示意圖Fig. 2 Schematic diagram of the image acquisition system

機器視覺系統主要由相機、鏡頭、圖像采集卡、光源、暗箱和計算機等組成，如圖2所示。光源為2 個140 mm×20 mm的白色LED條形光源，呈45°對稱分布置于載物臺上方，光源總功率為42.48 W，從而確保充足且均勻的光線條件。為了增強背景和樣品的對比度，以白色底板為背景對樣品的圖像進行采集。綜合考慮相機的視野面積及鏡頭的焦距，將鏡頭前端與背景底板之間的距離設置為20 cm，使明蝦樣品成像于像平面的中間區域，確保成像清晰。采集圖像時調整為手動曝光模式，鏡頭光圈值f=4.5，速率為1/100（關閉變焦和閃光燈功能），在“高分辨率”和“超高質量”照相模式下采集圖像，并將圖片以JPEG格式存儲。上述圖像采集過程在內壁涂成黑色的暗箱內進行，從而減少了外界光線的干擾。

1.3.4 TVB-N含量測定

光譜和圖像采集完成后，參照GB 5009.228—2016《食品中TVB-N的測定》，利用K1100型自動凱式定氮儀對蝦樣品中TVB-N含量進行測定[16-17]。將明蝦剝殼、絞碎，精確稱取（3.0±0.1）g蝦肉置于錐形瓶中，加入50 mL 20 g/L三氯乙酸溶液，每隔5 min攪拌，30 min后進行過濾，取濾液備用。然后，取10 mL濾液置于消化管中，并加入5 mL 10 g/L氧化鎂溶液，蒸餾5 min，再利用20 g/L硼酸溶液吸收，吸收液用0.05 mol/L的鹽酸進行滴定。每個樣品平行測試3 次，取3 次均值作為最終的結果。測樣品前，用10 mL 20 g/L三氯乙酸溶液代替濾液與5 mL 10 g/L氧化鎂溶液作為空白對照，重復以上操作。TVB-N含量按下式計算：

式中：X為樣品內TVB-N含量/（mg/100 g）；V1為試液消耗鹽酸標準滴定液的體積/mL；V2為試劑空白消耗鹽酸標準滴定液的體積/mL；C為鹽酸標準滴定液濃度/（mol/L）；m為試樣質量/g。

1.4 數據處理與模型構建

1.4.1 光譜數據處理與特征提取

圖3 雙波段融合過程流程圖Fig. 3 Flow chart of the dual-band spectral fusion process

較寬的波段范圍可以提供更多反映樣品TVB-N含量差異的光學信息，模型預測的效果也會更佳[18-19]。而本研究獲取的原始光譜為350～1 000 nm和940～1 650 nm波段范圍內的兩段獨立光譜，因此首先利用區域特征加權融合法對雙波段光譜進行有效融合，以獲取更加全面的光譜信息。具體操作為：1）截掉兩端噪音較大的區域，分別保留450～970 nm和940～1 650 nm范圍的光譜作為原始光譜，并對其進行平滑處理，進一步提高信噪比；2）在2 個波段光譜儀重疊的940～970 nm波段范圍內，根據波段二光譜儀獲取數據的波長點，等間距選取942.79、947.83、952.89、957.97、963.08、968.21 nm處共6 個波長位置，并利用樣條插值法求得波段一光譜儀在上述波長下的光譜數據。然后，對波段一光譜在上述6 個波長下的數據賦予權重1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0，對波段二對應波長下的數據賦予權重0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，保證每個波長下2 個波段光譜儀獲取數據的權重和為1，對雙波段光譜進行加權求和；3）將450～940 nm間的原始光譜、940～970 nm間融合后光譜和970～1 650 nm間原始光譜有效連接起來，從而獲取完整的融合后的雙波段連續光譜。光譜融合后，由于兩臺光譜儀的數據采集點間隔不同（分別為0.38 nm和5.36 nm），導致2 個波段光譜數據量有明顯差異，會對后續分析產生影響。因此，進一步利用樣條插值的方法，將融合后光譜以2 nm為間隔進行數據重排，使光譜數據能均勻分布。

光譜采集過程極易受到外界因素的影響，包括雜散光、樣品粒度、紋理等，因此需對光譜進行預處理，去除無關信息帶來的干擾[20]。本研究對比采用標準正態變量變換（standard normal variate transformation，SNV）、一階導數、二階導數3 種方法對光譜進行處理，同時對不同方法按不同順序組合使用對建模結果的影響進行了分析。此外，進一步利用競爭性自適應加權算法從眾多變量中優選了與TVB-N有關的特征變量，建立更為穩健可靠的預測模型。

1.4.2 圖像特征提取

在進行圖像特征分析和提取之前，需對圖像進行適當預處理，如背景分割、平滑去噪、形態學變換等，目的是濾除由采集設備帶來的隨機噪音、背景噪音以及樣品本身存在的固有影響，從而突出待分析目標的特征。由于明蝦目標區域和背景區域的顏色具有明顯的差異，且不同樣品圖像灰度有差異，不具有確定的分割閾值，因此本研究采用自適應閾值分割法進行背景分割。獲取的明蝦原始彩色圖像具有RGB三個通道，而閾值分割通常對灰度圖像進行處理，因此利用加權平均算法將彩色圖像轉換為灰度圖像，并利用基于灰度直方圖的圖像分割法實現明蝦和背景區域的分割。然后，對二值化圖像展開腐蝕操作，將邊緣部位的蝦腳蝦須消除掉，再進行圖像膨脹填充二值化圖像中的孔洞區域，從而得到較為完整的蝦的形狀圖像。最后，分別提取目標區域的顏色、面積、長度、寬度、描述圖像橢圓形狀的偏心率、等面積圓直徑和周長等特征。

1.4.3 模型構建與評價

模型構建采用SVM算法，該算法可以很好地處理非線性的辨識問題，構建的模型有較為強大的預測性能[21-22]。由于徑向基核函數能夠將非線性樣本數據映射到高維特征空間，在未獲得先驗知識指導時，也能夠獲得好的擬合結果[23-24]。因此本研究采用基于徑向基核函數的SVM算法構建光譜和圖像信息與TVB-N含量之間的關系模型。

模型的評價參數包括校正集相關系數（correlation coefficient in the calibration set，Rc）、預測集相關系數（correlation coefficient in the prediction set，Rp）、校正集標準分析誤差（standard error of calibration，SEC）、驗證集標準分析誤差（standard error of prediction，SEP）和相對分析誤差（relative percent deviation，RPD）。R P D ＞2.5，表示預測效果較好，預測精度較高；1.5＜RPD＜2.5，表示通過此方法進行定量分析可行，但模型預測能力不夠強大，預測精度有待提高；RPD＜1.5，表示該預測模型很難進行定量檢測分析，還需進一步優化[25-26]。

2 結果與分析

2.1 明蝦貯藏期間TVB-N含量分析

圖4明蝦貯藏期間TVB-N含量變化Fig. 4 Variation in TVB-N content in prawn during storage

根據海產品衛生標準（GB 2733—2015《鮮、凍動物性水產品》），海魚和蝦可接受的TVB-N含量小于30 mg/100 g。由圖4可知，貯藏開始時TVB-N含量較低為4.26 mg/100 g，第7天時超過30 mg/100 g腐敗臨界值，隨貯藏時間延長TVB-N含量增加，這主要是由于明蝦蛋白質含量較高，在酶和微生物的作用下，使蛋白質分解而產生氨及胺類等具有揮發性的堿性含氮物質，又結合因腐敗產生的有機酸形成TVB-N，進而其含量迅速上升。

基于獲取的光譜數據，利用Kennard-Stone算法將全部樣品按3∶1的比例分為校正集和驗證集，則有38 個樣品用于建立模型，13 個樣品用于對模型進行驗證。如表1所示，校正集樣品的TVB-N含量范圍為3.85～98.97 mg/100 g，涵蓋了較寬的范圍，能夠滿足對新鮮、次新鮮、腐敗和嚴重腐敗等不同樣品的檢測需求。且驗證集中樣品的TVB-N含量均在校正樣品覆蓋的范圍之內，表明該子集可以對模型的預測性能進行驗證。

表1明蝦的TVB-N含量Table 1Statistics of TVB-N content of prawn

2.2 基于光譜信息的明蝦TVB-N含量檢測

2.2.1 原始光譜信息解析

圖5 原始光譜（a）和雙波段融合原始光譜（b）圖Fig. 5 Dual-band raw spectrum (a) and fused spectra (b)

將原始光譜中兩端噪音較大的區域截掉，保留信噪比較高的450～970 nm和940～1 650 nm波段范圍的光譜信息用于后續分析。由圖5a可知，不同TVB-N含量的明蝦樣品的近紅外光譜曲線的譜形相似，但又不完全重合，既體現了樣品間的差異性，又體現了總樣品集的連續性。在450～1 650 nm的光譜區域內，樣品的近紅外光譜曲線出現多處吸收峰呈遞增或遞減的趨勢，472 nm處的吸收峰與高鐵肌紅蛋白有關，539 nm處的吸收峰與氧化血紅蛋白有關，580 nm和605 nm處的吸收峰與氧合肌紅蛋白有關，775～850 nm與N—H鍵的第三倍頻有關[27]。在冷藏過程中，該范圍內光譜發生變化是由于肌紅蛋白與硫化氫結合形成了肌紅蛋白硫化物或者被微生物產生的氫過氧化物氧化形成了黃色或綠色的膽色素。980 nm處的峰與O—H鍵的二級彎曲振動有關，1 060 nm與C—H鍵的振動有關，在1 180 nm附近是飽和烷烴C—H鍵伸縮振動的二級倍頻吸收帶，也是O—H鍵的合頻吸收帶，1 280 nm與N—H鍵振動有關[28]。此外，還可以看出在940～970 nm范圍內，2 個波段的光譜儀獲取的光譜數據并不重合，這是由于2 個波段光譜儀器性能不同，對于同一樣品采集得到的反射率不同，因而存在數據交叉現象，利用區域特征加權融合算法處理后的光譜如圖5b所示，可以看出兩段光譜得以無畸變的融合為一條連續的光譜，在940～970 nm的重疊波段范圍內，光譜曲線連接良好，并且節點處變化平緩。

2.2.2 基于不同波段全光譜數據建模分析

表2 不同波段全光譜SVM建模結果對比Table 2Comparison of full-spectrum SVM modeling results in different wavelength ranges

基于不同波段的光譜信息，采用不同的預處理方法建立明蝦樣品TVB-N含量的SVM模型，結果如表2所示。與利用原始光譜數據建立的SVM模型相比，利用預處理后光譜數據建立的SVM模型預測效果均有所提高，說明預處理方法可以有效地消除或降低光譜數據中的噪聲。基于第一波段的光譜信息，利用先一階導數再SNV處理的方法建立的模型最佳，其Rc為0.936 6，SEC為13.34 mg/100 g，Rp為0.913 0，SEP為15.19 mg/100 g，RPD為2.42，表明模型的結果還有待進一步提高。基于第二波段光譜信息建立的模型結果優于前者，這可能與波段二比波段一光譜的信噪比好，無關信息的干擾減少有關。最佳的預處理方法為先經過二階導數再進行SNV處理，模型的Rc為0.952 4，SEC為16.77 mg/100 g，Rp為0.9421，SEP為18.97 mg/100 g，RPD為2.53。與利用單一波段的光譜建模結果相比，利用雙波段融合后的光譜信息建立的模型精度最高，這可能與融合后的雙波段光譜包含的信息量更加豐富有關。最優結果為經過一階導數處理后建立的模型，其Rc為0.957 8，SEC為14.01 mg/100 g，Rp為0.931 9，SEP為16.39 mg/100 g，RPD為2.66。

2.2.3 基于特征波長的建模結果分析

上述建模過程中利用了450～1 650 nm全波段共602 個波長的數據，輸入變量的數據量過多，容易導致數據處理和模型建立時間過長，且光譜數據之間可能存在冗余或信息重疊的情況。因此，需要利用特征變量提取方法從602 個波長變量中選取少量有用的波長點數據，建立簡化的預測模型，同時進一步提高模型預測性能。本研究利用競爭性自適應加權算法篩選特征波長，設置采樣次數為100 次，最大潛變量數為5，并選擇十折交叉檢驗法。利用該方法最終篩選得到與TVB-N有關的12 個特征波長，分別為488、538、630、692、714、758、800、862、874、928、936 nm和1 034 nm，由于TVB-N屬于蝦肉中的胺類化合物，因此通過對TVB-N進行近紅外光譜分析即可測定含氫基團—OH、—CH、—NH和—SH的含量，結合圖5可知，488 nm處吸收峰與高鐵肌紅蛋白有關，538 nm處與氧化血紅蛋白有關，630 nm處與S—H鍵肌紅蛋白有關，758 nm處與O—H鍵的第三倍頻有關，800 nm處與N—H鍵的第三倍頻有關，1 034 nm與C—H鍵的振動有關[27-28]，反映了TVB-N含量與特征波長之間的關系。

以特征波長下的數據為因變量，以TVB-N標準參考值作為自變量，建立SVM模型，如圖6所示。與利用全光譜數據建模結果相比，模型結果有了較大的改善，Rc升高至0.977 4，SEC下降至8.21 mg/100 g，Rp升高至0.968 7，SEP下降至10.56 mg/100 g，RPD為3.38。RPD值有明顯提高，表明預測效果較好，預測精度較高，此預測模型可以應用到實際檢測當中。相比任瑞娟[5]利用近紅外光譜信息構建的預測對蝦5 ℃貯藏期間TVB-N含量的PLS模型效果要好，該模型Rp為0.876 0，SEP為12.93 mg/100 g。

2.3 基于機器視覺的明蝦TVB-N定量分析

圖7 明蝦圖像預處理過程Fig. 7 Prawn image preprocessing process

對于明蝦的外觀品質，一般是根據人的感官依據相應的標準進行評價，但由于感官評價受多種因素的影響，存在很大的主觀性和隨機性。利用計算機視覺技術對明蝦顏色、形狀等各項指標進行量化，能夠有效提高明蝦新鮮度評價的效率與準確度[29]。蝦圖像預處理過程如下圖所示。首先使用Matlab讀取文件并對圖7A進行二值化處理，使用自適應閾值變換法把灰度圖像轉換成二值圖像，將蝦從背景中提取出來（圖7B）。接著將二值化的圖像進行腐蝕操作，去除邊緣的蝦腳蝦須（圖7C），再進行圖像膨脹操作并填充二值圖像中的孔洞區域，從而獲得完整蝦的形狀（圖7D）。

表3 提取的特征像素信息Table 3 Extracted feature pixel information

獲取的圖像特征數據如表3所示，不同貯藏時間明蝦的R、G、B均值差異較小，說明顏色特征參數相似性較大；幾何特征中面積和周長的參數值有明顯不同，其中鮮蝦面積參數值最大為478 576.00，貯藏10 d的面積參數值最小為369 618.92；鮮蝦周長參數值最大為5 575.52，貯藏12 d的周長參數值最小為3 416.51，各參數均隨時間的延長呈下降趨勢，這可能是由于蝦肉水分含量高，體內酶活性強，再加上微生物的活動，蝦體很快變黑且無光澤，貯藏后期出現了汁液流失，甲殼、頭部脫落現象，蝦外觀品質變化較大[30]。在Matlab 2016a軟件中將圖像特征信息采用歸一化處理后再與TVB-N含量建立SVM模型，其Rc為0.955 8，SEC為16.39 mg/100 g，Rp為0.933 5，SEP為19.79 mg/100 g，RPD為1.74，此時1.5＜RPD＜2.5，即表示此建模方法可行，但模型預測能力不夠強大。這可能是因為某些樣品在冷藏期間受到不同程度的擠壓加速了蝦的腐敗變質進而對構建預測TVB-N含量的SVM模型產生干擾。

2.4 基于融合圖譜特征信息的明蝦新鮮度檢測分析

表4 3 種模型結果的比較Table 4 Performance comparison of the three models

蝦在冷藏過程中的新鮮度的變化通常伴隨著內部屬性（化學成分、組織結構等）和外部屬性（顏色、質地、氣味等）的變化。基于不同傳感器數據的融合可以從蝦樣本中獲取比單個傳感器數據更多的信息，進而可以全面評估蝦的新鮮度，從而獲得更好的TVB-N含量預測結果[31]。因此本實驗將提取的圖像特征信息與光譜特征信息進行融合建立SVM模型，模型評價結果見表4，通過3 種模型結果的對比可知，采用光譜特征信息所構建的模型效果較好，Rc為0.977 4，SEC為8.21 mg/100 g，Rp為0.968 7，SEP為10.56 mg/100 g，RPD為3.38；利用圖像特征信息建立的模型效果較差，Rc為0.955 8，SEC為16.39 mg/100 g，Rp為0.933 5，SEP為19.79 mg/100 g，RPD為1.74；利用融合圖譜特征信息建立的模型最有效，Rc為0.986 2，SEC為5.27 mg/100 g，Rp為0.988 4，SEP為7.51 mg/100 g，RPD為6.29，預測集相關系數有所提高，誤差顯著降低且RPD大于2.5，表明模型的預測能力有了明顯提高，與單一檢測方法相比，它具有信息量大和容錯性好等優點，較單獨采用光譜信息或圖像信息建立的模型效果要好。與陳全勝等[32]利用圖譜融合方式基于BP神經網絡方法建立的茶葉綜合品質評判模型的結果類似，結果表明，該融合模型可行，評判結果的準確性和穩定性都較單個信息模型有所提高。

3 結 論

為了獲得更為快速準確測定明蝦TVB-N含量的方法，本實驗探究單獨使用近紅外光譜技術和機器視覺技術以及融合圖譜特征信息3 種不同方式對建模結果的影響，最終確立了融合圖譜特征信息的方式建立的SVM模型，其Rc為0.986 2，SEC為5.27 mg/100 g，Rp為0.988 4，SEP為7.51 mg/100 g，RPD為6.29，校正集和驗證集誤差明顯降低，預測精度顯著提高。結果表明，融合圖譜特征信息的方式可以提高預測明蝦中TVB-N含量的性能，可為多源信息融合技術應用于蝦的新鮮度指標快速定量檢測提供參考，此外，還可為光譜與圖像技術在水產品應用上提供理論支持，后期可開發便攜式儀器，使其大規模投入應用。